曹 婭，孫 利，凌 云，趙延勝,3，高 慧，馮 峰，儲曉剛,*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

食用調(diào)味油是從植物或植物籽粒中提取的油脂或萃取呈味成分于植物油中的調(diào)味品，其主要成分為植物油。而植物油在長期儲存過程中會發(fā)生酸敗、腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生小分子醛、酮類的物質(zhì)危害人體健康。為了延緩其加工、貯藏以及食用過程中的氧化酸敗，改變油脂的表觀狀態(tài)，從而增加其銷售量，生產(chǎn)者常常在食用植物油中加入抗氧化劑等食品添加劑。但是，目前使用的食品添加劑大多是人工合成化合物，而食品生產(chǎn)過程中添加劑的違法超標(biāo)現(xiàn)象也十分嚴(yán)重，超標(biāo)使用會對人體造成不同程度的危害。同時一些非法添加物的加入，如三聚氰胺，蘇丹紅類色素會對老百姓的身體健康造成極大的損害。因此，加強食用植物油和調(diào)味油中食品添加劑檢測方法的研究，開發(fā)該類樣品中添加劑(物)的檢測方法是加強食品中添加劑和非法添加物監(jiān)管的有效途徑[1-2]。

當(dāng)前，針對食品添加劑常用檢測分析方法主要有生物傳感器法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、膠束電動毛細(xì)管色譜法(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC)[5]、離子色譜法[6]、氣相色譜法[7]、液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[10-11]和液相色譜-質(zhì)譜法[12]。生物傳感器法的靈敏度較低，毛細(xì)管電泳法精確度較低，Boyce[5]采用的MECC法檢測果醬和飲料中的食品添加劑的遷移時間RSD均大于在10.1%～20.1%之間。離子色譜法和酶聯(lián)免疫法的檢測范圍較窄：涂順等[4]使用酶聯(lián)免疫法只檢測了食品中的蘇丹類染色劑，離子色譜法適用于檢測有機酸和糖類，姚潯平等[13]使用離子排阻色譜法檢測啤酒中的有機酸。而氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的檢測范圍又有一定的限制。液相色譜方法的檢測范圍廣，選擇性好，但是準(zhǔn)確度不如質(zhì)譜，可能產(chǎn)生假陽性檢測結(jié)果。目前，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的技術(shù)可對化合物進行同時定性定量，準(zhǔn)確性較高，能夠滿足精確分析的要求。

為了去除基質(zhì)干擾，提高方法的靈敏度，前處理方法的優(yōu)化必不可少。目前用于食用植物油中食品添加劑檢測的常規(guī)前處理方法有固相萃取法(solid phase extraction，SPE)[14]、液液萃取法(liquid liquid extraction，LLE)[15]等。植物油和調(diào)和油主要成分為長鏈脂肪酸，采用液液萃取法便可將極性較強的抗氧化劑、防腐劑和甜味劑萃取出來，同時與油樣基質(zhì)互溶的、難以萃取的弱極性蘇丹類化合物可采用凝膠滲透色譜進行分離。本實驗應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)，通過優(yōu)化前處理方法和色譜質(zhì)譜條件，擬建立食用植物油和調(diào)味油中27種食品添加劑及非法添加物的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(HPLC級) 德國Merck公司；正己烷(HPLC級) 美國Honeywell公司；乙酸乙酯、環(huán)己烷(均為HPLC級) 美國Fisher科技公司。

根據(jù)化合物在質(zhì)譜上的電離模式，將27種目標(biāo)化合物分為A、B兩組，其中A組化合物蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅G、蘇丹紅7B、蘇丹橙G、蘇丹黃和對位紅(純度均大于97%) 美國Sigma-Aldrich公司；B組化合物水楊酸、乙萘酚、脫氫乙酸、聯(lián)苯酚和糖精(純度均大于98%) 瑞士Fluka公司；2,4-二氯乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、特丁基對苯二酚、叔丁基對羥基茴香醚、己基間苯二酚、2,4,5-三羥基苯丁酮、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸芐酯、3,5-二叔丁基-4-羥基芐醇、沒食子酸辛酯和去甲二氫愈創(chuàng)木酚(純度均大于97%) 美國Sigma-Aldrich公司，實驗用水均為超純水 美國Millpore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；串聯(lián)API5000三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Applied Biosystem公司；凝膠滲透色譜 德國LCTech公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 布琪公司。

1.3 樣品前處理

稱取油樣品0.5g(精確到0.01g)置于50mL離心管中，加入20mL乙腈飽和正己烷和5mL正己烷飽和乙腈，振蕩提取5min后，于10000r/min離心5min，移走乙腈層，正己烷層重復(fù)提取1次，合并乙腈層，用超純水定容至10mL，取1mL樣液采用0.2μm的濾膜過濾，待測。正己烷層經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1：1，V/V)的溶劑定容至10mL，經(jīng)凝膠滲透色譜除去油脂等雜質(zhì)，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，1mL乙腈定容后，0.2μm濾膜過濾，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 A組化合物的儀器條件

色 譜柱：A g i l e n t A t l a n t i s T 3 色譜柱(5 μ m，6mm×150mm)；柱溫：35℃；進樣體積5μL。流動相A為超純水，流動相B乙腈，梯度洗脫程序如下：0～1min，10%A；1～10min，10%～0%A；10～20min，0%A；20～20.01min，0%～10%A；20.01～24min，10%A。流速為0.50mL/min。

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)：正離子模式；毛細(xì)管電壓：5.5kV；碰撞氣：10psi，氣簾氣：25psi，霧化氣：50psi，輔助氣：40psi，離子源溫度：550℃。各化合物采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方式，母離子/子離子對均設(shè)為單位分辨，各參數(shù)見表1。

1.4.2 B組化合物儀器條件

色譜柱：A g i l e n t A t l a n t i s T 3 色譜柱(5 μ m，6mm×150mm)；柱溫：40℃；進樣體積5μL。流動相A為0.1%乙酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序如下：0～12min，60～10% A；12～20min，10% A；20～20.01min，10～60% A；20.01～29min，60% A。流速0.5mL/min。

電噴霧離子源：負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：4.5kV，碰撞氣：5kPa，氣簾氣：15kPa，霧化氣：40kPa，輔助氣：25kPa，離子源溫度：550℃。各化合物采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測方式，母離子/子離子對均設(shè)為單位分辨，各參數(shù)見表1。

表 1 ESI模式下各化合物的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectral conditions for detecting 27 compounds in standard solutions

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取試劑的選擇及萃取次數(shù)的優(yōu)化

本實驗樣品為植物油和調(diào)和油，其主要成分為長鏈脂肪酸，采用液液萃取方式便可將極性較強的抗氧化劑、防腐劑和甜味劑萃取出來。實驗對比乙腈、甲醇和水對B組化合物的萃取效果，在相同的油樣中加入質(zhì)量濃度為100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，萃取結(jié)果如圖1所示，大多數(shù)化合物在乙腈作為萃取液時萃取效率較高，因此選擇乙腈作為B組化合物的萃取液。為了保證目標(biāo)化合物的萃取回收率，并且盡量減少前處理的繁瑣步驟以及目標(biāo)化合物的損失。本實驗對乙腈的提取次數(shù)進行比較，在油樣中加入100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液后振蕩萃取1、2、3次，每次萃取完畢后乙腈層都定容上機測定。結(jié)果表明兩次萃取的回收率在86.5%～110.1%之間，滿足檢測要求。因此，本實驗的萃取次數(shù)選擇兩次。

圖 1 不同提取液下防腐劑、抗氧化劑和甜味劑的色譜峰響應(yīng)值Fig.1 Effect of extraction solvents on chromatographic peak responses of food additives

2.1.2 GPC條件優(yōu)化

圖 2 色素的GPC收集情況圖Fig.2 GPC profiles of food pigments

由于食用調(diào)味油中含有的主要成分為植物油，本實驗對市場上銷售的植物油：花生油、菜籽油、芝麻油、棉籽油、葵花籽油、亞麻油、紅花籽油和大豆油進行了GPC分析。分別取以上各植物油進行紫外分析，結(jié)果表明各油樣的出峰時間都在16min之前。通過分段收集和分析對色素的洗脫時間進行確定。油樣中加入A組化合物標(biāo)準(zhǔn)液后，收集十個小瓶，每個小瓶收集300s。實驗結(jié)果如圖2所示，表明A組化合物在35min內(nèi)可收集完全。因此GPC方法為前餾分1000s不收集；1000～2200s收集；2200～2500s沖洗凝膠色譜柱，不收集。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 B組化合物的流動相優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動相的組成除了影響分析物的保留時間和峰形外，還會影響到分析物的離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的檢測靈敏度。本實驗對于B組化合物分別采用乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-5mmol/L的乙酸銨/乙酸緩沖溶液和乙腈-5mmol/L的甲酸銨/甲酸緩沖溶液4個體系作為流動相,考察不同流動相組成對于分析物峰形，離子化效率的影響。由于0.1%的甲酸和加入緩沖鹽的流動相對于體系的抑制過于強烈，所以色譜峰的響應(yīng)較低。從圖3可以看出，以乙腈-0.1%乙酸溶液作為流動相時大多數(shù)添加劑的響應(yīng)值最高。因此，本實驗采用乙腈和0.1%乙酸水作為流動相。

圖 3 不同流動相下防腐劑、抗氧化劑和甜味劑的色譜峰響應(yīng)值Fig.3 Effect of mobile phase composition on chromatographic peak responses of food additives

2.2.2 A組流動相的優(yōu)化

圖 4 不同流動相下的油溶性色素的色譜峰響應(yīng)值Fig.4 Effect of mobile phase composition on chromatographic peak responses of oil-soluble pigments

對于A組化合物流動相選擇，實驗比較乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-20mmol/L乙酸銨溶液和乙腈-20mmol/乙酸銨/0.1%乙酸緩沖溶液四個體系，由于超純水對于本實驗的體系有較少的抑制作用，色譜峰的響應(yīng)較高。如圖4所示，以超純水作為流動相時大多數(shù)添加劑的響應(yīng)值最高。因此，本實驗采用乙腈和超純水作為流動相。

表 2 各化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、添加回收率、精密度及檢出限(n=5)Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, recoveries, precision (RSD) and limits of detection (n=5)

2.2.3 柱溫的選擇

圖 5 優(yōu)化條件下防腐劑、抗氧化劑和甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of preservatives, antioxidants and sweeteners under the optimum conditions

柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中可以發(fā)揮重要作用，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，溫度的不平衡會導(dǎo)致峰扭曲變形。因此，如果想得到穩(wěn)定可靠的分離結(jié)果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。本實驗比較的柱溫分別為30、35、40℃和45℃，通過峰形的對比，對于B組化合物的較優(yōu)柱溫為40℃，對于A組化合物的較優(yōu)柱溫為35℃。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過單個分析物標(biāo)準(zhǔn)品溶液上機分析，得到目標(biāo)分析物的質(zhì)荷比。為了進一步對化合物進行確證分析，在碰撞誘導(dǎo)解析電離模式(collision induced dissociation，CID)下，通過分析單個目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓，得到離子豐度較大的碎片離子為該化合物裂解的主要碎片離子。表1為ESI模式下，各化合物的主要碎片離子的質(zhì)荷比。MRM模式下防腐劑、抗氧化劑、以及甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子流圖見圖5，MRM模式下油溶性色素標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子流圖見圖6。

2.4 方法的線性方程和檢出限

配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液， 質(zhì)量濃度為0.25～250μg/L(其中TBHQ為500～2000μg/L)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)組分的峰面積為y軸，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各種添加劑和非法添加物在以上質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.983?；厥章屎途芏鹊臏y定通過向空白油樣中添加質(zhì)量濃度水平A類化合物為10μg/L，B類化合物為100μg/L的添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來進行，每個質(zhì)量濃度樣品平行分析5次。各化合物回收率在78.2%～108.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～17.7%。結(jié)果見表2。

2.5 市售樣品檢測

圖 7 陽性樣品的MRM色譜圖Fig.7 MRM chromatogram of positive sample

配對北京市市售的37種品牌的食用植物油和調(diào)味油進行測定，其中包括有6種植物調(diào)和油、10種芝麻油、3種橄欖油、7種花椒油、6種辣椒油和5種其他調(diào)味油。實驗測定37種調(diào)味油中有5種含有抗氧化劑TBHQ，含量分別是54.1、44.8、35.0、14.4mg/L和4.0mg/L，含量均低于我國限量要求。樣品的譜圖見圖7。TBHQ是我國食用植物油中常規(guī)使用的抗氧化劑。

3 結(jié) 論

在本實驗建立了食用植物油和調(diào)味油中27種食品添加劑和非法添加物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。方法的精密度，線性關(guān)系和檢測限均滿足目標(biāo)物分析的要求，可用于我國分析實驗室的食品安全相關(guān)檢測。

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