侯 瀟，高 建，李春雨，王 錚，金莉莉，王秋雨*

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

馬鹿茸、馬鹿骨為可用于保健食品的生物資源。馬鹿角為已骨化的鹿茸或鋸茸后翌年春季脫落的角基，具有溫腎陽、強(qiáng)筋骨、行血消腫的功效[1]。馬鹿角膠為馬鹿角煎熬而成的膠塊，主要成分是蛋白質(zhì)，含量為83.81%[2]，有補(bǔ)腎陽、益精血和抗疲勞及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的作用[3-4]。馬鹿角膠的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大，難以透過生物膜，生物利用度低，通過化學(xué)、物理或酶解方法，降低蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，可提高蛋白質(zhì)的吸收率和保健功能[5]。據(jù)報(bào)道[2]鹿角膠經(jīng)中性蛋白酶水解后能顯著提高正常雄性大鼠血清中睪酮水平，提高了鹿角蛋白的功能。大豆蛋白、牛乳酪蛋白、雞蛋清等通過酶法水解制備的多肽具有良好的免疫活性[6]。

為提高馬鹿角的生物利用率和生理藥理活性，本實(shí)驗(yàn)組在前期工作中研究了馬鹿角蛋白的提取和最佳酶解工藝[7]。馬鹿角粉碎后，經(jīng)80～90℃水浸法提取蛋白，3000r/min離心除去不溶物，上清液經(jīng)濃縮干燥得到馬鹿角蛋白。采用1kD超濾膜截留未酶解的蛋白，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到白色粉末狀的馬鹿角蛋白酶解物。酶解物易溶于水，多肽含量99%，Tricine-SDS-PAGE鑒定分子質(zhì)量小于3kD。采用BCA試劑盒測(cè)定馬鹿角蛋白和酶解物的蛋白含量。本實(shí)驗(yàn)研究該酶解物的抗氧化、抗疲勞和免疫活性，并與未水解的馬鹿角蛋白進(jìn)行比較，以期為馬鹿角蛋白的精深加工和高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

體質(zhì)量為28～30g的30日齡、清潔級(jí)昆明小鼠100只，雌雄各半，購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

馬鹿角購于鐵嶺西豐鹿產(chǎn)品交易中心；馬鹿角蛋白及酶解物在本實(shí)驗(yàn)室制備得到[7]。

丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；刀豆蛋白A (ConA) 美國(guó)Sigma公司；香菇多糖 浙江普洛康裕天然藥物有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 體外抗氧化活性的測(cè)定

將VC配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的溶液，將馬鹿角蛋白和馬鹿角酶解物分別稀釋成10、20、30、40、50mg/mL的溶液。作為待測(cè)液備用。

清除O2－·活性的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法；清除·OH活性的測(cè)定采用水楊酸法；總還原力的測(cè)定采用鐵氰化鉀法[8-10]。

式中：ΔA對(duì)照為對(duì)照組鄰苯三酚自氧化時(shí)吸光度每分鐘變化量；ΔA樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化時(shí)吸光度每分鐘變化量。

式中：A0為對(duì)照組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

1.2.2 體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

30只昆明小鼠，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組(同體積生理鹽水)、馬鹿角蛋白組(500mg/(kg·d))、馬鹿角蛋白酶解物組(500mg/(kg·d))。實(shí)驗(yàn)組蛋白和酶解物灌胃劑量參考海參肽功能研究使用劑量[11]。連續(xù)灌胃30d后，摘眼球取血，1500r/min離心取血清，檢測(cè)馬鹿角蛋白酶解前后對(duì)血清中SOD活性和MDA含量的影響。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行[12]。

1.2.3 抗疲勞活性研究

30只昆明小鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組(同體積生理鹽水)、馬鹿角蛋白組(500mg/(kg·d))、馬鹿角蛋白酶解物組(500mg/(kg·d))。連續(xù)灌胃給藥30d后進(jìn)行負(fù)重游泳、肝糖原、血乳酸3項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)：在末次灌胃后30min后，將小鼠的尾部負(fù)荷5%體質(zhì)量的鉛皮然后放入水深30cm、水溫(25±1)℃的游泳箱中游泳，記錄小鼠力竭游泳時(shí)間，即從入水至沉入水下10s不能浮出水面的時(shí)間[13]。血乳酸測(cè)定：小鼠于末次給予受試物30min后，在水深30cm、水溫30℃的游泳箱中不負(fù)重游泳10min后，眼球采血測(cè)定血清血乳酸含量[14]。肝糖原測(cè)定：小鼠于末次給予受試物30min后，30℃水箱中游泳10min，頸椎脫臼處死，取肝臟100mg，用蒽酮法測(cè)定肝糖原含量[15]。

1.2.4 免疫活性研究

40只昆明小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(同體積生理鹽水)、陽性香菇多糖組(145mg/(kg·d))、馬鹿角蛋白組(500mg/(kg·d))、馬鹿角蛋白酶解物組(500mg/(kg·d))。連續(xù)灌胃給藥30d后進(jìn)行小鼠碳廓清率和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指標(biāo)的測(cè)定[11,16]。

1.2.4.1 小鼠碳廓清率測(cè)定

小鼠連續(xù)給藥30d，按10mL/kg尾靜脈注射稀釋4倍的印度墨汁，注射后開始計(jì)時(shí)，分別于2、10min時(shí)眼眶取血20μL，立即置于盛有2mL 0.1% Na2CO3溶液的試管中。在波長(zhǎng)600nm處測(cè)其光密度OD1和OD2，測(cè)其吞噬指數(shù)α，以表示碳廓清率。

式中：t1、OD1為給墨汁后第一次取血的時(shí)間及所測(cè)OD值；t2、OD2為給墨汁后第二次取血的時(shí)間及所測(cè)OD值。

1.2.4.2 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

小鼠連續(xù)給藥30d后, 脫頸處死，75%酒精浸泡消毒3min后無菌取脾，將脾磨碎，200目篩網(wǎng)過濾，Hanks液清洗2次，每次洗后1000r/min離心10min，制備單細(xì)胞懸液，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL，臺(tái)酚蘭染色應(yīng)使活細(xì)胞數(shù)量在95%以上。將一份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔板，每孔1mL，一孔加75μL ConA，另一孔對(duì)照，培養(yǎng)68h時(shí)每孔吸去0.7mL上清液，加入0.7mL不含血清培養(yǎng)液，同時(shí)每孔加入5mg/mL MTT 50μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。結(jié)束后加入1mL酸性異丙醇吹打混勻。測(cè)每一份脾細(xì)胞懸液在570nm波長(zhǎng)處的OD值，脾淋巴細(xì)胞增殖能力用OD實(shí)驗(yàn)組與OD對(duì)照組的差值表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鹿角蛋白酶解物的體外抗氧化能力

圖 1 馬鹿角蛋白和馬鹿角蛋白酶解物的O2－·清除能力(n=3)Fig.1 Comparison of superoxide anion radical scavenging activity between red deer antler protein and hydrolysate(n=3)

由圖1可知，馬鹿角蛋白酶解物對(duì)O2－·的清除能力明顯高于同等質(zhì)量濃度的馬鹿角蛋白，隨著測(cè)試質(zhì)量濃度的增加而增大。馬鹿角蛋白的半清除質(zhì)量濃度(IC50)為45.57mg/mL，而馬鹿角酶解物IC50為10.59mg/mL。陽性照組VC的IC50為0.42mg/mL。

圖 2 馬鹿角蛋白和馬鹿角蛋白酶解物的·OH清除能力(n=3)Fig.2 Comparison of hydroxyl radical scavenging activity between red deer antler protein and hydrolysate (n=3)

由圖2可知，馬鹿角蛋白酶解物對(duì)·OH的清除能力與同等質(zhì)量濃度的馬鹿角蛋白相比，差異極顯著，隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除能力呈增大的趨勢(shì)。馬鹿角蛋白的半清除質(zhì)量濃度(IC50)為45.20mg/mL，而酶解物的IC50為7.63mg/mL。陽性對(duì)照組VC的IC50為0.28mg/mL。

由圖3可知，馬鹿角蛋白和酶解物均具有還原能力，且隨著質(zhì)量濃度增加而增大。同等質(zhì)量濃度的馬鹿角蛋白酶解物的還原力高于馬鹿角蛋白，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩者差異極顯著。

圖 3 馬鹿角蛋白和馬鹿角蛋白酶解物的總還原能力(n=3)Fig.3 Comparison of total reducing power between red deer antler protein and hydrolysate (n=3)

2.2 馬鹿角蛋白酶解物的體內(nèi)抗氧化能力

圖 4 馬鹿角蛋白和馬鹿角蛋白酶解物對(duì)小鼠血清中SOD(A)、MDA(B)的影響(n=10)Fig.4 Comparative effects of red deer antler protein and hydrolysate on serum SOD activity (A) and MDA content (B) in mice (n=10)

由圖4可知，飼喂馬鹿角蛋白組、馬鹿角蛋白酶解物組的小鼠SOD活性和MDA含量與空白對(duì)照組相比均有極顯著差異性，顯示抗氧化功能顯著，且酶解物組SOD的活性和MDA的減少量均好于馬鹿角蛋白組，并具有顯著性差異。

2.3 馬鹿角蛋白酶解物的抗疲勞活性

圖 5 馬鹿角蛋白及馬鹿角蛋白酶解物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間(A)、血乳酸含量(B)和肝糖原含量(C)的影響(n=10)Fig.5 Comparative effects of red deer antler protein and hydrolysate on weight-loaded swimming time (A) and blood lactic acid (B) and liver glycogen contents (C) in mice(n=10)

由圖5可知，與空白對(duì)照組相比，馬鹿角蛋白組和酶解物組的小鼠游泳時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸含量降低，肝糖原含量增加，均有顯著性或極顯著性差異，酶解物的抗疲勞活性更強(qiáng)。

2.4 馬鹿角蛋白酶解物的免疫活性

圖 6 馬鹿角蛋白和馬鹿角蛋白酶解物對(duì)小鼠碳廓清吞噬指數(shù)α(A)和脾淋巴細(xì)胞增殖能力(B)的影響(n=10)Fig.6 Comparative effects of red deer antler protein and hydrolysate on carbon clearance index (A) and lymphocyte proliferation (B) in mice (n=10)

由圖6可知，馬鹿角蛋白和馬鹿角蛋白酶解物能提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)α和脾淋巴細(xì)胞增殖能力，與空白對(duì)照組比較差異極顯著，且馬鹿角蛋白酶解物組活性高于馬鹿角蛋白組，具有顯著性差異。

3 討 論

O2－·和·OH是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，它們可以引起體內(nèi)脂質(zhì)過氧化。而使用生物抗氧化劑切斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以抑制機(jī)體的自由基損傷，從而保持最佳健康狀態(tài)和防治相關(guān)疾病，延緩衰老[17-18]。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，可專一性清除O2－·，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，MDA含量可以間接反映出機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度[19]。本研究通過對(duì)以上指標(biāo)的檢測(cè)，顯示馬鹿角蛋白及其酶解物具有清除O2－·、·OH的能力和總還原力，可提高受試小鼠血清SOD活力并降低MDA含量，與空白對(duì)照組相比差異顯著，且酶解物組活性高于未酶解的馬鹿角蛋白。研究結(jié)果表明馬鹿角蛋白酶解物具有顯著的抗氧化活性。

在抗疲勞實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定了受試小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、能量物質(zhì)肝糖原和代謝產(chǎn)物血乳酸三項(xiàng)指標(biāo)。各指標(biāo)在運(yùn)動(dòng)時(shí)的變化程度與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷強(qiáng)度一致的條件下，可作為動(dòng)物疲勞的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。力竭游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以反應(yīng)受試動(dòng)物運(yùn)動(dòng)抗疲勞的能力[21]，疲勞發(fā)生的早晚與糖原的儲(chǔ)備直接相關(guān)，乳酸作為肌肉活動(dòng)的主要代謝產(chǎn)物，可以通過肌肉乳酸的含量來評(píng)價(jià)疲勞的程度[22]。持續(xù)運(yùn)動(dòng)后血乳酸的數(shù)值越低，表明疲勞消除越快。通過對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，表明馬鹿角蛋白及其酶解物具有抗疲勞功效，與空白對(duì)照組比較差異顯著，馬鹿角蛋白酶解物的抗疲勞作用更強(qiáng)。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)生物學(xué)作用最為活躍的細(xì)胞，具有吞噬、殺傷及消化病原體、殺傷腫瘤細(xì)胞，并在特異性免疫應(yīng)答中參與抗原的提呈及免疫調(diào)節(jié)作用[23]。淋巴細(xì)胞是體內(nèi)免疫活性細(xì)胞，淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱，反應(yīng)機(jī)體免疫功能的高低[24]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)碳廓清吞噬指數(shù)研究表明：馬鹿角蛋白及其酶解物對(duì)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能具有明顯的促進(jìn)作用，能提高小鼠對(duì)血中碳粒膠體廓清速度，酶解物組的作用更為明顯；用ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，馬鹿角蛋白及其酶解物的促淋巴細(xì)胞增殖能力與空白對(duì)照組相比較具有顯著差異性，后者的作用更明顯。

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