王歲樓，王海翔，楊志萍，呂春暉，步 芬

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

β-胡蘿卜素具有提高人體免疫力、抗氧化、防癌抗癌等重要的生理功能，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域[1]。利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素具有發(fā)酵周期短、營養(yǎng)要求簡單、菌體營養(yǎng)豐富可直接作飼料等許多其他微生物所不具備的優(yōu)點(diǎn)[2]。但目前所報道的紅酵母菌種β-胡蘿卜素產(chǎn)率都較低[3]，據(jù)工業(yè)生產(chǎn)尚有差距。因此，對紅酵母β-胡蘿卜素生物合成技術(shù)的進(jìn)一步研究具有重要意義。

目前國內(nèi)外有關(guān)紅酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素方面的研究，多集中于對紅酵母菌種的自然篩選、發(fā)酵與色素提取條件的優(yōu)化以及對新原料、新技術(shù)的探索等方面[4-9]。在菌種選育方面，雖然國內(nèi)外都有誘變育種的報道[10-12]，但由于誘變育種盲目性大、工程浩大、周期長，國內(nèi)外這方面的研究報道都不多?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展和引入，加強(qiáng)了獲取高產(chǎn)菌株的目的性，據(jù)報道[13]日本已有人獲得了產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌?？偟膩砜矗瑢N選育包括誘變、原生質(zhì)體融合及基因工程育種方面鮮有研究報道[14-17]，有些類似研究工作的目標(biāo)產(chǎn)物也不是β-胡蘿卜素而是蝦青素、番茄紅素等其他類胡蘿卜素，以β-胡蘿卜素為目標(biāo)產(chǎn)物的紅酵母菌種選育研究更少。

法夫酵母Ph-1的β-胡蘿卜素產(chǎn)量較高(7.21mg/L)，但最適生長溫度(20℃)和生物量(14.62g/L)都較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)之用；本實驗分離出的黏紅酵母NR-98菌株，雖然β-胡蘿卜素產(chǎn)量(6.03mg/L)比法夫酵母Ph-1低，但生物量(19.85g/L)比法夫酵母Ph-1高，并且最適生長溫度也較高(28℃)適宜大生產(chǎn)之用。因此，如果用這兩株菌作為親本，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，有望獲得能在28℃良好生長的高產(chǎn)β-胡蘿卜素的融合子。本實驗通過系統(tǒng)研究兩種酵母菌原生質(zhì)體制備、再生及融合的影響因素，最終篩選出一株比較理想的融合子R-5，具有實際應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)NR-98 本實驗分離保藏；法夫酵母(Phaff ia rhodozyma)Ph-1 中國科學(xué)院微生物研究所。

三羥甲基氨基甲烷(Bis-Tris) 洛陽天騁化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇(PEG)-6000(進(jìn)口分裝) 上?；瘜W(xué)試劑站；蝸牛酶、β-巰基乙醇 北京百泰生化技術(shù)公司；溶菌酶、纖維素酶 華美生物工程公司。

1.2 培養(yǎng)基和溶液

葡萄糖液體培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、NH4Cl 0.5%、K2HPO40.02%、MgSO40.02%，pH 6.0；葡萄糖固體培養(yǎng)基：葡萄糖液體培養(yǎng)基中加瓊脂2%；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨2%、酵母膏1%，pH 6.0，250mL三角瓶分裝50mL；蔗糖高滲再生培養(yǎng)基：在葡萄糖培養(yǎng)基中加入17%的蔗糖。以上培養(yǎng)基均在115℃滅菌20min。

檸檬酸-磷酸高滲緩沖液：檸檬酸80.7g、磷酸氫二鈉45.23g、蔗糖205.38g、蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃滅菌20min；助融劑：PEG-6000 35%，CaCl20.01mol/L，蔗糖0.6mol/L；其他溶液：0.05mol/L的EDTA溶液，0.5mol/L的β-巰基乙醇溶液。以上溶液均在121℃滅菌20min。1%蝸牛酶溶液，過濾除菌即可。

1.3 儀器與設(shè)備

HYG-Ⅲ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；LD5-10離心沉淀機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；QL-901旋渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；756MC型紫外-可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；XSP-16A普通光學(xué)顯微鏡 南京光學(xué)儀器廠。

1.4 培養(yǎng)與測定方法

種子培養(yǎng)方法：將法夫酵母Ph-1和黏紅酵母NR-98菌株分別接種于葡萄糖固體斜面培養(yǎng)基，分別置20℃及28℃恒溫培養(yǎng)，48h后各挑取一環(huán)接種于盛有10mL葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，分別置20、28℃恒溫振蕩培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速150r/min。

發(fā)酵培養(yǎng)方法：將上述種子培養(yǎng)液按5%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，法夫酵母Ph-1置20℃，黏紅酵母NR-98置28℃，恒溫振蕩培養(yǎng)72h，150r/min。

β-胡蘿卜素的提取及測定方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.5 原生質(zhì)體的制備及再生

1.5.1 原生質(zhì)體的制備將法夫酵母Ph-1和黏紅酵母NR-98分別接種于葡萄糖固體斜面，置20℃和28℃恒溫培養(yǎng)48h后各取一環(huán)接種于盛有5mL葡萄糖液體培養(yǎng)基的試管中，分別置20、28℃振蕩培養(yǎng)16h后，分別接入含有50mL葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，振蕩培養(yǎng)8h，使細(xì)胞處于對數(shù)生長前期。將上述培養(yǎng)液在3500r/min條件下離心10min，沉淀用無菌生理鹽水洗滌離心2次，將菌體懸浮于10mL β-巰基乙醇和EDTA混合液中(1mL 0.5mol/L的β-巰基乙醇和25mL 0.05mol/L的EDTA混合)，30℃振蕩處理10min，分別取1mL處理菌液，適當(dāng)稀釋后用平板菌落計數(shù)法，測定未經(jīng)酶處理的細(xì)胞數(shù)A。然后3500r/min離心10min收集菌體，用檸檬酸-磷酸高滲緩沖液洗滌2次，離心后把菌體懸浮于5mL水解酶溶液中，在30℃條件下酶解60min，并隨時用顯微鏡觀察細(xì)胞形成原生質(zhì)體情況，酶解后，以3500r/min離心20min，收集菌體，用檸檬酸-磷酸高滲緩沖液洗2次，再把菌體懸浮在9mL檸檬酸-磷酸緩沖液中。

原生質(zhì)體形成率的測定：取上述原生質(zhì)體懸浮液各1mL，用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后涂布于葡萄糖培養(yǎng)基平板上(法夫酵母置20℃，黏紅酵母NR-98置28℃)培養(yǎng)48h，計菌落數(shù)為B，為未脫壁的細(xì)胞數(shù)，則原生質(zhì)體形成率計算用公式(1)。

1.5.2 原生質(zhì)體的再生

取兩親本原生質(zhì)體懸浮液各1mL，分別用高滲緩沖液適當(dāng)稀釋后涂布于葡萄糖再生培養(yǎng)基平板，法夫酵母于20℃培養(yǎng)，黏紅酵母NR-98于28℃培養(yǎng)，48h后，計菌落數(shù)為C，為未脫壁細(xì)胞數(shù)與原生質(zhì)體再生細(xì)胞數(shù)之和，則原生質(zhì)體再生率計算用公式(2)。

1.6 原生質(zhì)體的滅活及融合

黏紅酵母NR-98原生質(zhì)體的滅活：為了獲得遺傳缺陷型標(biāo)記，對菌株NR-98進(jìn)行紫外滅活處理。取黏紅酵母NR-98的原生質(zhì)體懸浮液(濃度為5×107個/mL)，倒入無菌的培養(yǎng)皿中，于20W紫外燈下保持30cm的垂直距離照射不同的時間，每隔5min搖動1次。照射完畢，取樣鏡檢原生質(zhì)體是否破裂或裂解。同時在照射前后分別取原生質(zhì)體懸浮液涂布高滲平板，在28℃培養(yǎng)48h以觀察存活情況。存活率以照射前后在高滲平板上生長的菌落數(shù)之比計。

原生質(zhì)體的融合：取法夫酵母Ph-1的原生質(zhì)體和經(jīng)過滅活的黏紅酵母NR-98的原生質(zhì)體按1：1的比例混合于離心試管中，28℃條件下振蕩15min，3500r/min離心20min，收集菌體加入5mL助融劑PEG-6000，28℃振蕩處理20min，離心收集細(xì)胞，用檸檬酸-磷酸高滲緩沖液洗滌，最后懸浮于5mL檸檬酸-磷酸緩沖液中。吸取1.0mL上述細(xì)胞液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，涂布于再生培養(yǎng)基平板上，置28℃恒溫培養(yǎng)48h。

1.7 融合子的篩選與確定

融合子的篩選：親本法夫酵母Ph-1最適生長溫度為20℃，菌落為較大的橙黃色；黏紅酵母NR-98最適生長溫度為28℃，菌落為較小的淺紅色或淡橙黃色。由于黏紅酵母NR-98原生質(zhì)體已經(jīng)被滅活，兩親本原生質(zhì)體都不可能在28℃再生，因此能在28℃良好生長并且菌落大、顏色與法夫酵母顏色相同者(橙黃色)應(yīng)為融合子。挑取具有該特征的菌落若干個，在葡萄糖固體培養(yǎng)基上以劃線法分離純化后，接種于葡萄糖斜面培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48h后，進(jìn)行種子擴(kuò)大及發(fā)酵培養(yǎng)，測定生物量和β-胡蘿卜素含量。融合子β-胡蘿卜素含量的測定，方法同前述，但所有菌株放在28℃條件下恒溫培養(yǎng)。

融合子遺傳穩(wěn)定性的檢驗：把產(chǎn)量高于雙親的菌株，在葡萄糖固體培養(yǎng)基上進(jìn)行10次傳代接種后，再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)測定生物量和β-胡蘿卜素含量，方法同前述。

細(xì)胞大小的測定：用顯微測微尺測量細(xì)胞的長軸(a)和短軸(b)，每株測定50個細(xì)胞，取平均值，按式(3)計算細(xì)胞體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備及再生

2.1.1 菌齡對原生質(zhì)體形成的影響

細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)在細(xì)胞不同的時期有所不同，因而細(xì)胞對酶的敏感性有差異。通過測定生長曲線及不同培養(yǎng)時期細(xì)胞原生質(zhì)體形成率，發(fā)現(xiàn)法夫酵母Ph-1和黏紅酵母NR-98原生質(zhì)體化的較適菌齡為12～16h左右，約處于對數(shù)生長早期。

2.1.2 預(yù)處理對原生質(zhì)體形成和再生的影響

對細(xì)胞進(jìn)行酶解破壁之前，可采用0.2% β-巰基乙醇和0.06mol/L的EDTA對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。一般認(rèn)為，硫醇化合物可切開細(xì)胞壁中的二硫鍵，使其對酶更敏感；EDTA作為螯合劑，可以避免金屬離子對酶活力的影響，從而提高原生質(zhì)體的形成率，但會降低原生質(zhì)體的再生率。由表1可知，預(yù)處理促進(jìn)了原生質(zhì)體的形成，但對再生無顯著的不利影響。

表 1 預(yù)處理對原生質(zhì)體制備的影響Table 1 Effect of pretreatment on the formation and rebirth of protoplasts

2.1.3 酶系統(tǒng)對原生質(zhì)體形成的影響

表 2 不同的酶系統(tǒng)對原生質(zhì)體形成率的影響Table 2 Effect of enzymatic system on protoplast formation

分別用0.6mol/L蔗糖的滲透壓穩(wěn)定劑配制各個酶系統(tǒng)，以考察不同酶及濃度對原生質(zhì)體形成的影響，由表2可知，在僅使用一種酶作用的情況下，1%蝸牛酶的酶解效果最好，兩親本的原生質(zhì)體形成率最高；其次是溶菌酶，而纖維素酶效果較差。用3種酶以不同方式組合的酶系統(tǒng)均比單酶酶解效果好，其中效果最好的是3酶組合系統(tǒng)，即蝸牛酶1%、溶菌酶0.5%、纖維素酶1%。

2.1.4 酶解溫度和時間對原生質(zhì)體形成的影響

表 3 酶解溫度對原生質(zhì)體形成的影響Table 3 Effect of enzymatic reaction temperature on protoplast formation

表 4 酶解時間對原生質(zhì)體形成的影響Table 4 Effect of enzymatic reaction time on protoplast formation

從表3、4可以看出，隨著酶解溫度和時間的增加，兩親本的原生質(zhì)體形成率增大，但并不是持續(xù)增大，適宜的作用條件為酶解溫度30℃、酶解時間1.5h。

2.1.5 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體形成和再生的影響

表 5 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體形成的影響Table 5 Effect of osmotic pressure on the formation and rebirth of protoplasts

滲透壓穩(wěn)定劑為細(xì)胞裂解釋放出的原生質(zhì)體提供了一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，使原生質(zhì)體不會發(fā)生破裂。由表5可知，采用0.6mol/L蔗糖作穩(wěn)定劑，兩親本的原生質(zhì)體形成率和再生率最高，而且保持16h左右未見破裂。

2.1.6 原生質(zhì)體化的結(jié)果

表 6 最適制備條件下原生質(zhì)體形成率及再生率Table 6 Formation and rebirth rates of protoplasts under the optimal preparation conditions

表6是在上述各單因素試驗所確定的最優(yōu)制備條件組合下(菌齡12～16h、預(yù)處理、三酶系統(tǒng)、酶解溫度30℃、酶解時間1.5h、0.6mol/L蔗糖穩(wěn)定劑)，兩親本原生質(zhì)體化的結(jié)果。由表6可知，黏紅酵母NR-98的原生質(zhì)體形成率高于法夫酵母Ph-1，而后者的原生質(zhì)體再生率要高于前者，但兩親本的原生質(zhì)體再生率都有待進(jìn)一步提高。另外，由圖1可知，黏紅酵母的脫壁效果較好，絕大多數(shù)菌落會由橢圓形變成圓球形(法夫酵母結(jié)果與此類似)。

圖 1 黏紅酵母細(xì)胞去壁前(a)和去壁后(b)及其原生質(zhì)體Fig.1 Rhodotorula glutinis and its protoplasts

2.2 原生質(zhì)體的滅活及融合結(jié)果

2.2.1 原生質(zhì)體滅活條件的選擇

為了獲得遺傳缺陷型標(biāo)記，采用單親本紫外線滅活法。將親本黏紅酵母NR-98的原生質(zhì)體在預(yù)熱30min的紫外燈(20W)距離30cm條件下，分別照射25、30、35、40、45min進(jìn)行滅活，稀釋后涂布在高滲平板上于28℃培養(yǎng)48h，同時做對照實驗，統(tǒng)計長成的單菌落數(shù)并計算存活率(即照射前后在高滲平板上生長的菌落數(shù)之比)。表7結(jié)果顯示，黏紅酵母NR-98原生質(zhì)體在照射40min時的滅活率可達(dá)到100%，而且此時鏡檢觀察原生質(zhì)體是完整的。

表 7 紫外線對親本NR-98原生質(zhì)體致死劑量的確定Table 7 Survival rate of protoplast NR-98 treated with UV

2.2.2 融合劑PEG-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

融合劑PEG有穩(wěn)定原生質(zhì)體和促進(jìn)核分裂的作用，也有利于細(xì)胞壁的形成和再生，可大幅度誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。由表8可知，在本實驗中PEG-6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在35%時，兩原生質(zhì)體的融合效果最好，融合頻率可達(dá)5.78×10-5(融合頻率=B×稀釋倍數(shù)/A，其中B為再生培養(yǎng)基上的單菌落數(shù)，A為每毫升總的原生質(zhì)體數(shù))。由于PEG-6000對原生質(zhì)體的毒性和原生質(zhì)體對有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定劑的敏感性，PEG-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能過大，否則融合頻率會迅速下降。

表 8 PEG-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對融合頻率的影響Table 8 Effect of PEG-6000 concentration on fusant formation

2.2.3 融合時間的影響

為研究融合時間對原生質(zhì)體融合的影響，分別以5、10、15、20、25、30min共6個融合時間進(jìn)行實驗。由表9可知，在本實驗中融合時間以20min為宜，處理時間過長原生質(zhì)體可能因脫水而失活，時間過短則融合頻率低。

表 9 融合時間對融合頻率的影響Table 9 Effect of fusion time on fusant formation

2.2.4 Ca2+濃度的影響

一般認(rèn)為，在PEG誘導(dǎo)融合時，一定濃度的Ca2+、Mg2+，能更有效地促進(jìn)融合。由表10可知，本實驗中Ca2+濃度以0.05mol/L時融合率最高。

表 10 Ca2+濃度對融合頻率的影響Table 10 Effect of Ca2+ concentration on fusant formation

2.3 融合子的篩選與鑒定結(jié)果

2.3.1 融合子的篩選

表 11 融合子與親本的β-胡蘿卜素發(fā)酵結(jié)果對照Table 11 β-Carotene production by fusants and parent strains

從原生質(zhì)體融合后的再生培養(yǎng)基平板上，分離篩選了5株在28℃生長旺盛，菌落大而厚，顏色與黏紅酵母NR-98菌株不同而與法夫酵母Ph-1顏色相同的橙黃色菌株，編號后接種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對它們的生物量、β-胡蘿卜素含量等進(jìn)行了研究，結(jié)果見表11，上述5株融合子的生物量都高于法夫酵母Ph-1，β-胡蘿卜素含量都高于黏紅酵母NR-98，因而β-胡蘿卜素產(chǎn)量均高于黏紅酵母NR-98，其中R-1、R-3、R-5的β-胡蘿卜素產(chǎn)量還高于法夫酵母Ph-1，分別比法夫酵母Ph-1提高了13.16%、14.96%和27.42%。

2.3.2 融合子的遺傳穩(wěn)定性

表 12 各融合子在連續(xù)10次傳代后的β-胡蘿卜素發(fā)酵結(jié)果Table 12 β-Carotene fermentation by the tenth generation fusants

把表12結(jié)果與表11對照可以看出，融合子R-1、R-3和R-5菌株的生物量、β-胡蘿卜素含量及單位體積發(fā)酵液中β-胡蘿卜素產(chǎn)量基本上是穩(wěn)定的，可以說它們都是遺傳上穩(wěn)定的融合子。

2.3.3 融合子細(xì)胞的大小

當(dāng)兩親本細(xì)胞融合后，其細(xì)胞體積會增大。由表13可知，融合子R-5的長短軸及細(xì)胞體積都有不同程度的增大，因此應(yīng)是真正的融合子。

表 13 兩親本及融合子R-5的細(xì)胞大小Table 13 Cell sizes of parents and fusant R-5

3 結(jié)論與討論

通過黏紅酵母NR-98與法夫酵母Ph-1菌株的原生質(zhì)體融合研究，成功地篩選出了β-胡蘿卜素產(chǎn)量高于兩親本的具有遺傳穩(wěn)定性的融合子R-5，β-胡蘿卜素產(chǎn)量不僅比黏紅酵母NR-98提高53.33%，而且比法夫酵母Ph-1(7.22mg/L)提高了27.42%，達(dá)9.20mg/L。對該融合子發(fā)酵生理學(xué)及β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的優(yōu)化是今后進(jìn)一步研究的課題，以便充分發(fā)揮其產(chǎn)生β-胡蘿卜素的能力。

影響原生質(zhì)體制備及融合的因素很多[10,14]，如水解酶及其作用條件(酶用量、酶處理溫度、作用時間和pH值等)、菌齡、菌體預(yù)處理、培養(yǎng)基組成、滲透壓穩(wěn)定劑及助融劑等。在研究紅酵母原生質(zhì)體形成時，首先使用了一些常規(guī)的裂解酶如蝸牛酶等，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)化率較低。這可能是因為紅酵母的細(xì)胞壁堅韌，而且細(xì)胞個體小，所以很難原生質(zhì)化。同時使用蝸牛酶、溶菌酶和纖維素酶時原生質(zhì)體形成率明顯提高。另外，同時使用β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)、裂解酶(lysing enzyme)及酵母溶壁酶(lyticase) 3種酶時[15]，紅酵母原生質(zhì)化率也大大提高。實驗中發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體相比原始細(xì)胞，形狀發(fā)生了較大變化，接近于圓形；折光度也有較大提高，液泡更加清晰。今后對原生質(zhì)體制備條件的進(jìn)一步優(yōu)化及原生質(zhì)體融合中某些新技術(shù)如紫外滅活技術(shù)、電融合技術(shù)等的應(yīng)用都是要深入研究的內(nèi)容。

一般認(rèn)為原生質(zhì)體融合獲得的融合子，其重組率較之常規(guī)的要高很多，但選擇融合子依然是非常困難的，需要有比較好的篩選標(biāo)記[11]。本實驗中選擇的篩選標(biāo)記都是親本自身的生理生化特征，即選擇能在28℃生長、顏色為較大的黃色菌落轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，同時考察其β-胡蘿卜素產(chǎn)量高于黏紅酵母10%者，初步認(rèn)為是融合子。雖然在融合前對親本之一的黏紅酵母進(jìn)行了紫外線滅活，但“滅活法”對原生質(zhì)體純度要求很高，必須經(jīng)過一定的方法分離純化以除去菌絲殘片。另外，由于紅酵母自身不能合成硫胺素，故可考慮在缺硫胺素的基本培養(yǎng)基中檢出融合子。但是，紅酵母在只有碳、氮源的基本培養(yǎng)基中，依然可以長出正常的菌落，因此也不能作為篩選標(biāo)記。本實驗以細(xì)胞本身的生理生化特征為篩選標(biāo)記雖然簡便可行，但工作量大，也不具有一定的篩選壓力，自然難以達(dá)到很理想的結(jié)果。因此，必須獲得有更好篩選標(biāo)記的菌株才能得到穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良融合子，例如通過紫外誘變篩選營養(yǎng)缺陷型的紅酵母突變株作融合的親本，這方面的實驗仍在進(jìn)行中。

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