馬志虎， 孫國勝， 張昌偉， 楊玉霞， 潘躍平

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

葉色變異是植物中比較常見的突變類型，一般在苗期表達，但少數(shù)突變體直到生育后期才發(fā)生葉色突變［1-2］。作物葉色突變體不僅可以作為雜交育種中的形態(tài)學(xué)標(biāo)記材料［3］，還在光合作用機制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的發(fā)育和遺傳控制機理、以及分析鑒定功能基因等研究方面具有重要的利用價值［4-7］。芽黃(Yellow bud mutant)是指幼苗或者植株葉片在前期明顯黃化，而后期葉綠素含量逐漸增加，以致黃化葉片完全變成綠色與正常綠色植株無異［8-9］。關(guān)于芽黃葉色標(biāo)記的遺傳規(guī)律及其實際應(yīng)用，在番茄、棉花、向日葵、西瓜、黃瓜、玉米等作物上已有報道［1］。目前種子純度鑒定以田間鑒定為主，缺乏快速有效的方法［10］，芽黃突變體可在苗期作為標(biāo)記性狀剔除雜種，用于提高雜交種純度，能夠簡化良種繁育［10］的步驟。

辣椒(Capsicum annuum L.)黃綠苗突變體(Mutant)屬基因突變引起的芽黃突變體(Yellow bud mutant)類型，是馬志虎等于1997年在由甘肅酒泉引進的辣椒品種96-140牛角辣椒中發(fā)現(xiàn)的葉色(幼嫩生長點為黃色)黃綠色隱性突變體材料［11］。利用該突變材料，先后選育辣椒新品種鎮(zhèn)椒八號和辣椒黃綠苗胞質(zhì)雄性不育系。本研究以辣椒黃綠苗突變體幼嫩葉片為材料，采用 Clontech公司的 In-Fusion?SMARTerTMDirectional cDNA Library Construction Kit試劑盒構(gòu)建辣椒cDNA全長文庫，為篩選辣椒葉色突變相關(guān)基因和探討葉色突變分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以辣椒葉色黃綠色隱性突變體 YBM1106—2321作為試驗材料(由鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，辣椒黃綠苗突變體與本所辣椒材料H2321雜交轉(zhuǎn)育而成，具有幼嫩生長點為黃色，新生平展葉片快速轉(zhuǎn)綠特性的葉片黃綠色隱性突變體新材料)。In-Fusion?SMARTerTMDirectional cDNA Library Construction Kit和 AdvantageTM2 PCR Kit試劑盒購自Clontech公司，CTAB、瓊脂糖以及其他常用試劑均購自Generay公司。

1.2 方法

1.2.1 改良CTAB法提取總RNA 采用王艷等［12］的改良CTAB法提取辣椒幼嫩真葉總RNA。

1.2.2 SMARTer技術(shù)構(gòu)建全長cDNA文庫 Firststrand cDNA和ds cDNA均采用LD-PCR技術(shù)，F(xiàn)irststrand cDNA反應(yīng)體系如下。SMARTer cDNA合成:在 PCR 管中加入2.00 μl RNA，1.00 μl 3'In-Fusion SMARTer CDS Primer(12 μmol/L)，1.50 μl ddH2O，混勻后72℃反應(yīng)3 min，42℃反應(yīng)2 min后，加入事先準(zhǔn)備好的如下混合液:2.00 μl 5×First-strand buffer，0.25 μl DTT(100 mmol/L)，1.00 μl dNTP mix(10 mmol/L)，1.00 μl SMARTer V Oligonucleotide(12 μmol/L)，0.25 μl RNase inhibitor，1.00 μl SMARTScribeTMreverse transcriptase(100 U)，共計10.00 μl體系，渦旋混合后短暫離心，42℃保溫90 min，然后68℃反應(yīng)10 min，－20℃保存。

Ds cDNA反應(yīng)體系:PCR管中加入2.00 μl Firststrand cDNA，80.00 μl ddH2O，10.00 μl 10 × Advantage 2 PCR buffer，2.00 μl 50 × dNTP mix(10 mmol/L)，2.00 μl 5'PCR primer II A(12 μmol/L)，2.00 μl 3'In-fusionSMARTerPCR primer(12 μmol/L)，2.00 μl 50 ×Advantage 2 polymerase mix，反應(yīng)體系為100.00 μl，2管。將反應(yīng)物放入95℃預(yù)熱的PCR儀里按如下參數(shù)反應(yīng):95℃ 1 min，95℃15 s，65℃30 s，68℃ 6 min。首先反應(yīng)15個循環(huán)，將2個PCR管取出來放在4℃冰箱，其中一管取出25.00 μl，將25.00 μl放入PCR儀按照上述參數(shù)每反應(yīng)3個循環(huán)取出5.00 μl，將反應(yīng) 15、18、21、24、27 個循環(huán)的樣品進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最佳反應(yīng)循環(huán)數(shù)。將剩余的170.00 μl樣品平均分成兩管，加入10.00 μl 1%的二甲苯青，－20℃保存。

Ds cDNA分級純化:按照說明書要求，準(zhǔn)備CHROMA SPIN+TE-1000柱和16個1.5ml離心管并做好標(biāo)記，將柱子輕輕搖勻，把柱子下端掰掉，打開上面的蓋子，讓柱子里的緩沖液自然流出，流速40 ～60 s 1滴，1滴40.00 μl左右，若達不到上述要求則要重新裝柱，直到滿足條件。待儲藏的緩沖液流盡以后，在柱子里加入700.00 μl柱緩沖液，待流干以后，將含有二甲苯青的ds cDNA加到柱子表面，靜止片刻，用100.00 μl柱緩沖液洗含有cDNA的管子，等到液體自然流干以后，藍色的二甲苯青會滲入柱子里面幾毫米。向柱子里面加入600.00 μl柱緩沖液，開始收集流份，每個離心管1滴。每管取3.00 μl進行1.1%瓊脂糖凝膠電泳，將最先出現(xiàn)條帶的4～5部分合并。向合并的樣品中加入1/10體積的醋酸鈉(3 mol/L;pH 4.8)，1.30 μl糖原，2.5倍體積－20℃預(yù)冷的95%乙醇，混勻后－20℃過夜，然后室溫14 000 r/min離心20 min，去掉上清液后，加入600.00 μl 80%的乙醇，室溫14 000 r/min離心5 min，去上清液，室溫干燥10 min后用10.00 μl ddH2O溶解沉淀。

連接載體:連接反應(yīng)按照說明書上的要求，共做3 個反應(yīng)(表1)，每個反應(yīng)10.00 μl，50 ℃連接15 min后迅速置于冰上。每管反應(yīng)液中加入90.00 μl TE和10.00 μl QuickClean松脂，渦旋1 min后離心一下，吸取上清液，加入1.20 μl糖原，混勻后加入280.00 μl 100%乙醇，前后搖晃混勻，－70℃沉淀過夜。然后15 000 r/min室溫離心20 min，小心去除上層乙醇，室溫干燥后，加入10.00 μl DEPC水溶解沉淀。

表1 cDNA與載體連接梯度體系Table 1 Reaction systems for ligating cDNA into vector

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:在預(yù)冷的1 cm的電轉(zhuǎn)杯中加入25.00 μl大腸桿菌感受態(tài)細胞 Electro-cells DH5α 和10.00 μl連接產(chǎn)物，1 500 V 電壓下脈沖5.2 ms。電轉(zhuǎn)產(chǎn)物子225 r/min、37℃培養(yǎng)1 h后取2.00 μl均勻涂抹到含有 100 μg/ml氨芐青霉素、1 mmol/L IPTG、75 μg/ml X-Gal的 LB 培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，剩余的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物4℃下保存。

文庫質(zhì)量的檢測:從培養(yǎng)過夜的平板中挑取24個白斑單克隆，分別培養(yǎng)在含有100 μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、225 r/min培養(yǎng)4 h，取菌液進行PCR檢測。體系如下:14.40 μl ddH2O，0.40 μl Forward screening primer(10 μmol/L)，0.40 μl Reverse screening primer(10 μmol/L)，1.60 μl dNTP(10 mmol/L)，2.00 μl 10 × PCR buffer，1.00 μl菌液，0.20 μl Taq 聚合酶，共 20.00 μl。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)，72℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后取5.00 μl PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

文庫滴度的測定:取10.00 μl文庫，加入1 ml LB培養(yǎng)基，取10.00 μl稀釋100倍的文庫，加入1 ml LB培養(yǎng)基。然后取10.00 μl稀釋100倍的文庫加入50.00 μl LB 培養(yǎng)基后涂板，取稀釋 50.00 μl稀釋10 000倍的文庫涂板，培養(yǎng)過夜后計算文庫滴度。

2 結(jié)果

2.1 辣椒葉片總RNA提取

提取RNA以后，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(圖1)顯示:28S和18S條帶亮度大約2∶1，說明RNA質(zhì)量比較好。OD260/OD280值為1.98，說明RNA純度較高，沒有雜質(zhì)污染，濃度為1 815.2 μg/ml，可以用于后續(xù)試驗。

圖1 辣椒葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose electrophoretogram of total RNA from the leaves of Capsicum annuum L.

2.2 辣椒葉片F(xiàn)irst-strand cDNA和ds cDNA合成

合成First-strand cDNA和 ds cDNA后，將15、18、21、24和27個循環(huán)后的ds cDNA進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖2)顯示:15、18個循環(huán)的條帶亮度很低，21個循環(huán)的條帶分布在2 000 bp左右，24和27個循環(huán)的產(chǎn)物片段過長，表明21個循環(huán)后的cDNA比較合適，符合文庫構(gòu)建要求。

圖2 辣椒葉片雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose electrophoretogram of double strand cDNA from the leaves of Capsicum annuum L.

2.3 辣椒葉片cDNA的分級純化

過完柱子的cDNA進行1.1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(圖3)顯示:cDNA從第6管開始出現(xiàn)，故合并6～9個流份進行連接，將剩余的cDNA舍去。

圖3 過完柱子的辣椒葉片cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose electrophoretogram of double strand cDNA from the leaves of Capsicum annuum L.after size fractionation

2.4 辣椒cDNA文庫質(zhì)量鑒定

將3個連接反應(yīng)的產(chǎn)物與載體連接后涂板，根據(jù)說明書要求測定各反應(yīng)的滴度，結(jié)果顯示，Ds cDNA反應(yīng)體系的連接效果最好，滴度為1.76×106PFU/ml，cDNA 與載體比例為2.25∶1.00。挑取 24個單克隆進行PCR擴增后，結(jié)果(圖4)顯示:片段大小在500～2 000 bp之間，平均長度為1 170 bp，重組率為94%。

圖4 辣椒葉片cDNA文庫片段PCR檢測Fig.4 PCR detection of cDNA library from the leaves of Capsicum annuum L.

3 討論

Clontech公司的 SMART(Switching mechanism at 5'end of RNA template)技術(shù)是現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的cDNA文庫構(gòu)建策略［13-14］，本文應(yīng)用最新的SMARTer技術(shù)進行cDNA文庫構(gòu)建，其優(yōu)點是所需材料少，50 ng RNA就可以滿足試驗要求，方便快捷，效率高。SMARTer技術(shù)通過用SMARTer V Oligo對5'端加上特定的接頭序列，引物在5'端與接頭結(jié)合就能合成全長cDNA，大大提高了試驗效率。此外，第一鏈和第二鏈cDNA合成都采用LD-PCR技術(shù)，起始RNA用量少，50 ng就能滿足建庫要求。本試驗中，采用改良CTAB法提取RNA，克服辣椒葉片多糖、次生物質(zhì)多［15］對RNA提取的影響，能夠提取到高純度、高完整性、高濃度的RNA，滿足文庫構(gòu)建的要求。文庫構(gòu)建是在RNA水平上進行的，避免了純化mRNA的步驟，能夠避免純化過程中RNA的降解以及mRNA的損耗，保證cDNA合成時能夠獲得全長cDNA。

SMARTer技術(shù)在cDNA與載體連接時，不需要進行酶切，可以直接與載體pSMART2IFD連接，避免在酶切回收時對cDNA的損失，大大提高了連接效率。設(shè)計3個連接反應(yīng)，能夠找到合適的片段與載體的比例。文庫構(gòu)建完成以后對文庫質(zhì)量的評估是通過文庫滴度、插入片段的大小以及重組率來進行［16］。本試驗構(gòu)建的辣椒葉片cDNA文庫的滴度為1.76 ×106PFU/ml，插入片段平均為1 170 bp，重組率94%，比較理想，能夠滿足后期試驗對目的基因篩選的要求。

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