胡秋俠，李博，鐘貴芳，何偉珍，孔衛(wèi)紅，黃進(jìn)賢

（1.深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院門(mén)診，廣東深圳518040；2.深圳市第四人民醫(yī)院香蜜湖風(fēng)濕病分院風(fēng)濕科，廣東深圳518040；3.深圳市第四人民醫(yī)院急診科，廣東深圳518040)

SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子4 mRNA的表達(dá)及其與血清IFN-γ水平之間的相關(guān)性

胡秋俠1，李博2，鐘貴芳3，何偉珍2，孔衛(wèi)紅2，黃進(jìn)賢2

（1.深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院門(mén)診，廣東深圳518040；2.深圳市第四人民醫(yī)院香蜜湖風(fēng)濕病分院風(fēng)濕科，廣東深圳518040；3.深圳市第四人民醫(yī)院急診科，廣東深圳518040)

目的探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子4 (STAT4)mRNA表達(dá)及其與血清干擾素(IFN-γ)水平之間的相關(guān)性。方法用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)60例SLE患者及30例正常對(duì)照者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)水平，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)SLE患者血清中IFN-γ的水平，并分析兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)水平在SLE患者組中要顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，并且在SLE患者病情活動(dòng)組中顯著高于病情非活動(dòng)組(P＜0.05)。SLE患者血清中IFN-γ水平檢測(cè)結(jié)果為(12.71±5.68)ng/ml，并與患者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.769，P＜0.05)。結(jié)論SLE患者PBMC中STAT4 mRNA的表達(dá)水平高于正常，并與病情活動(dòng)性及患者血清中IFN-γ水平相關(guān)。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4；mRNA表達(dá)；γ干擾素

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是最常見(jiàn)的自身免疫性疾病之一，臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜。SLE患者最顯著的特征之一是血清中存在以抗核抗體(ANA)為代表的多種自身抗體。許多研究結(jié)果顯示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)的基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)在多個(gè)種族SLE患者中均為SLE的易感基因，可能與SLE的發(fā)病相關(guān)[1-6]。但有關(guān)STAT4 mRNA表達(dá)及其臨床意義的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究旨在探討廣東省SLE患者PBMC中STAT4 mRNA的表達(dá)及其與血清IFN-γ水平之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有入選的60例(女50例，男10例)SLE患者均來(lái)自本院風(fēng)濕科2006年9月至2012年5月間的門(mén)診及住院患者，所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1997年修訂的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。入選患者的年齡最小為18歲，最大為67歲，中位數(shù)為40歲。所有同時(shí)合并有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎及其他彌漫性結(jié)締組織病的患者均被排除。所有同時(shí)合并有結(jié)節(jié)病、移植物抗宿主病、獲得性免疫缺陷綜合征及淋巴瘤的患者亦被排除。入選的30例正常對(duì)照者為在本院體檢的正常人，其中女性25例，男性5例，年齡最小為19歲，最大為63歲，中位數(shù)為39歲，性別組成與年齡分布與SLE患者組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 STAT4 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)采集以上研究對(duì)象EDTA抗凝靜脈血12 ml，用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC細(xì)胞?？俁NA的抽提采用Trizol試劑，操作完全按照其說(shuō)明。STAT4 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(美國(guó)ABI公司)。引物及TaqMan探針的序列分別如下：正向引物序列為5'-CTACACA TACGCCACCCTGACC-3'，反應(yīng)體系完全按照試劑盒說(shuō)明。反應(yīng)條件如下：60℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，接著95℃10 min以激活Taq酶，然后95℃20 s、55℃30 s、72℃1 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

1.2.2 IFN-γ的檢測(cè)所有受試者均晨起空腹采集靜脈血3 ml，離心10 min，分離出血清分裝于EP管，置于-20℃冰箱保存待測(cè)。IFN-γ的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 SLE臨床資料的收集記錄入選SLE患者的臨床及輔助檢查資料?；颊叩膶?shí)驗(yàn)室檢查主要包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿常規(guī)、腎功能、肝功能、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、ANA(間接免疫熒光法)抗心磷脂抗體(aCL)、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)、抗ds-DNA抗體及抗ENA抗體等。其中aCL、ANCA、抗anti-dsDNA抗體及抗ENA抗體的檢測(cè)使用ELISA法。類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)、血清補(bǔ)體(C3、C4)及免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)的檢測(cè)使用免疫比濁法，SLE患者的病情活動(dòng)性采用SLEDAI進(jìn)行評(píng)分，SLEDAI評(píng)分＞9定義為病情活動(dòng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman's相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者與正常對(duì)照者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)水平的比較SLE患者與正常對(duì)照者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析后顯示PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)水平在SLE患者組中要顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，并且在SLE患者病情活動(dòng)組中顯著高于病情非活動(dòng)組(P＜0.05)。

表1 SLE患者與正常對(duì)照者PBMC中STAT4 mRNA的表達(dá)水平

表1 SLE患者與正常對(duì)照者PBMC中STAT4 mRNA的表達(dá)水平

注：aSLE患者組與正常對(duì)照者組比較，b病情活動(dòng)組與病情非活動(dòng)組比較。

組別SLE患者病情活動(dòng)組病情非活動(dòng)組正常對(duì)照者例數(shù)60 32 28 30 mRNA表達(dá)水平3.475±0.526 4.918±0.932 3.132±0.263 1.613±0.276 t值1.782 1.817 P值0.000a0.001b

2.2 SLE患者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)與患者血清IFN-γ水平之間的相關(guān)性SLE患者血清中IFN-γ水平檢測(cè)結(jié)果為(12.71±5.68)ng/ml，相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)SLE患者血清IFN-γ水平與患者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.769，P＜0.05)。

3 討論

STAT4屬于STAT轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，主要表達(dá)在細(xì)胞的胞漿，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。STAT4基因位于人染色體2q32.2-2q32.3，以前的研究結(jié)果提示該區(qū)域的臨近區(qū)域2q33與SLE發(fā)病連鎖[7]。Remmers等[1]報(bào)道發(fā)現(xiàn)STAT4基因rs7574865位點(diǎn)的SNP與北美類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及SLE患者的發(fā)病相關(guān)。Kobayashi等[2]在日本患者中、Palomino-Morales等[3]在哥倫比亞患者中及Yang等[4]在中國(guó)香港SLE患者中分別對(duì)以上研究結(jié)果進(jìn)行了證實(shí)。Namjou等[5]后來(lái)在不同種族SLE患者中研究發(fā)現(xiàn)包括rs7574865位點(diǎn)在內(nèi)的多個(gè)STAT4基因位點(diǎn)的SNP與SLE發(fā)病相關(guān)。Hellquist等[6]在芬蘭患者中還報(bào)道發(fā)現(xiàn)STAT4基因rs7582694位點(diǎn)及rs10181656的SNP和正常人相比存在異常。還有兩個(gè)不同的研究顯示特定的STAT4基因型與SLE的某些臨床表現(xiàn)相關(guān)，例如抗ds-DNA抗體、抗心磷脂抗體的產(chǎn)生、缺血性股骨頭壞死及其他一些較嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)[8-9]。柏素云等[10]報(bào)道發(fā)現(xiàn)STAT4基因rs7574865位點(diǎn)的SNP與山東漢族SLE特定的臨床表現(xiàn)相關(guān)，以上研究結(jié)果已經(jīng)提示STAT4基因可能是SLE的易感基因，與SLE的發(fā)病相關(guān)。

已有的有關(guān)STAT4與SLE的研究大多集中在STAT4基因多態(tài)性與表達(dá)在SLE中存在異常，有關(guān)STST4引起SLE發(fā)病的可能具體機(jī)制尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。既往的動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)STAT4基因敲除小鼠缺乏許多IL-12誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，包括IFN-γ的產(chǎn)生及Th1細(xì)胞的分化，致使形成Th2優(yōu)勢(shì)[11]。另外，眾所周知，Th1/Th2失衡是SLE的一個(gè)顯著特征，這種失衡是否與患者體內(nèi)STAT4的表達(dá)存在關(guān)系，目前亦不明確。本研究在國(guó)內(nèi)外率先進(jìn)行了這方面的研究，對(duì)中國(guó)大陸SLE患者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)及患者血清中IFN-γ水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)水平在SLE患者組中要顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，并且在SLE患者病情活動(dòng)組中顯著高于病情非活動(dòng)組(P＜0.05)。SLE患者血清中IFN-γ水平檢測(cè)結(jié)果為(12.71±5.68)ng/ml，并與患者PBMC中STAT4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.769，P＜0.05)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)其他有關(guān)類(lèi)似的研究報(bào)道。

綜上所述，廣東省SLE患者PBMC中STAT4 mRNA的表達(dá)水平增高，并與病情活動(dòng)性及患者血清中IFN-γ水平相關(guān)，提示STAT4參與SLE發(fā)病的可能機(jī)制，但此結(jié)果尚待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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Correlation of mRNA level of STAT4 in peripheral blood mononuclear cells with IFN-γ level in serum in patients with systemic lupus erythematosus

HU Qiu-xia1,LI Bo2,ZHONG Gui-fang3,HE Wei-zhen2,KONG

Wei-hong2,HUANG Jin-xian2.1.Department of Emergency,Shenzhen Futian TCM Hospital,Shenzhen 518040, Guangdong,CHINA;2.Department of Rheumatology,Xiangmihu Branch of Shenzhen Fourth People's Hospital,Shenzhen 518040,Guangdong,CHINA;3.Department of Emengency,Shenzhen Fourth People's Hospital,Shenzhen 518040, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the correlation of mRNA level of STAT4 in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)with IFN-γ level in serum in patients with systemic lupus erythematosus(SLE).MethodsPeripheral blood samples from patients with SLE(n=60,the study group)and healthy individuals(n=30,the control group)wereused to detect STAT4 mRNA level by TaqMan real-time RT-PCR and to evaluate IFN-γ level in serum by ELISA methods.ResultsThe STAT4 mRNA level was significantly higher in the study group than the control group,and was also significantly higher in active SLE patients than in non-active SLE patients(P＜0.05).The IFN-γ level in serum was(12.71±5.68),and was positively associated with STAT4 mRNA level(r=0.769,P＜0.05).ConclusionA significant correlation is found between mRNA level of STAT4 in PBMC and the disease activity or IFN-γ level in serum in patients with SLE.

Signal transducer and activator of transcription 4;mRNAexpression;IFN-γ

R593.24+1

A

1003—6350（2013）05—0627—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0271

2012-10-29)

深圳市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（編號(hào)：2005C10）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（醫(yī)療衛(wèi)生類(lèi)）（編號(hào)：201002145）

李博。E-mail：genefan@163.com