朱月,馬金蓮

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

真菌多糖對(duì)氧自由基的清除作用

朱月,馬金蓮

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

本文以真菌多糖對(duì)氧自由基的清除作用為論題，圍繞真菌多糖對(duì)氧自由基清除作用方法的研究、真菌多糖對(duì)氧自由基的清除作用及清除能力三個(gè)方面進(jìn)行了闡述.

真菌多糖；氧自由基；清除作用；清除能力

氧自由基又稱(chēng)游離基，是具有未配對(duì)的電子的氧原子、原子團(tuán)或分子.包括超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（· OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氮（1O2）、氫過(guò)氧自由基（（HOO·）、烷氧自由基（RO·）及烷過(guò)氧自由基（ROO·）等.

氧自由基是生物體代謝的中間產(chǎn)物.如：機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在于線粒體內(nèi)的呼吸鏈在電子傳遞過(guò)程中，伴隨著氧化磷酸化作用而生成ATP.但是在電子傳遞過(guò)程中也有電子漏出現(xiàn)象，所漏出的電子使氧生成自由基.線粒體中大約有1%～3%的氧可形成自由基.白細(xì)胞和多形核白細(xì)胞在吞食外來(lái)異物和細(xì)菌過(guò)程中產(chǎn)生呼吸爆發(fā)時(shí)，也可以釋放大量氧自由基[1]，此外外界環(huán)境中的陽(yáng)光輻射、空氣污染、吸煙、農(nóng)藥等都會(huì)使人體產(chǎn)生更多的氧自由基.

氧自由基活性較強(qiáng)，通常稱(chēng)之為活性氧.在正常的生理?xiàng)l件下生物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除保持相對(duì)的平衡狀態(tài)，使氧自由基發(fā)揮其特定的生理作用.但當(dāng)氧自由基過(guò)量時(shí)對(duì)人體和動(dòng)物體正常細(xì)胞和組織會(huì)造成損壞，并能引發(fā)多種疾患[2].越來(lái)越多的證據(jù)表明：衰老、人體免疫力下降、心臟病、老年癡呆癥、帕金森綜合癥、腫瘤、癌癥、炎癥、關(guān)節(jié)炎等疾病都與自由基有關(guān)[3].隨著自由基與衰老和疾病關(guān)系的研究，也引起諸多學(xué)者對(duì)氧自由基清除劑研究的關(guān)注.并發(fā)現(xiàn)在一些植物、大型真菌等生物體內(nèi)提取的多糖是很好的自由基清除劑.

本文以真菌多糖對(duì)氧自由基的清除作用為論題，圍繞真菌多糖對(duì)氧自由基清除作用方法的研究、真菌多糖對(duì)氧自由基的清除作用及清除能力三個(gè)方面進(jìn)行闡述.目的是為從事該方面研究的同行們提供較直接和快捷的研究方法參考；提升人們對(duì)真菌多糖的藥用價(jià)值、保健價(jià)值的認(rèn)識(shí)，為食用菌資源的開(kāi)發(fā)與利用提供參考.

1 真菌多糖對(duì)氧自由基清除作用方法的研究

1.1 真菌多糖對(duì)羥基自由基（·OH）清除作用研究的方法

1.1.1 H2O2-Fe2+-鄰二氮菲體系[4]-[7]

研究表明，在H2O2-Fe2+-鄰二氮菲體系中，F(xiàn)e2+既可與H2O2作用產(chǎn)生羥自由基(·OH)，也可與鄰二氮菲反應(yīng)生成Fe2+-鄰二氮菲配合物，該配合物在536nm波長(zhǎng)處有最大光吸收.如果Fe2+-鄰二氮菲配合物被體系中產(chǎn)生的·OH氧化生成Fe3+-鄰二氮菲，會(huì)導(dǎo)致Fe2+-鄰二氮菲的生成減少或消失，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)得的光吸收值減弱或消失.向體系中加入真菌多糖，反應(yīng)一段時(shí)間后，在536nm處測(cè)定光吸收值，若光吸收值降低不明顯或有升高，說(shuō)明體系中游離的· OH減少，對(duì)Fe2+-鄰二氮菲的氧化作用降低或作用消除.因此，依據(jù)加入真菌多糖前后光吸收值的變化來(lái)判斷真菌多糖是否有清除作用.清除能力的大小用清除率來(lái)表示.

1.1.2 H2O2-Fe2+-水楊酸體系[8]-[10]

H2O2-Fe2+-水楊酸體系中Fe2+與H2O2作用產(chǎn)生的羥自由基(·OH)與水楊酸相遇生成有色的2.3二羥基苯甲酸. 2.3二羥基苯甲酸在510nm波長(zhǎng)處光吸收值最大.向體系中加入某一種真菌多糖后，測(cè)定光吸收值，如果測(cè)得的光吸收值減小，說(shuō)明二羥基苯甲酸減少.這是由于真菌多糖對(duì)羥自由基的清除作用所致.因此可通過(guò)加入真菌多糖前后顏色的變化來(lái)反映體系中的羥自由基濃度，并通過(guò)測(cè)定光吸收值的變化計(jì)算真菌多糖對(duì)羥自由基的清除率，依此判定某種真菌多糖對(duì)羥自由基是否有清除作用及清除能力的強(qiáng)弱.

1.1.3 H2O2-Fe2+-甲基紫反應(yīng)體系[11]

構(gòu)建H2O2-Fe2+-甲基紫體系，體系中的甲基紫在酸性溶液中呈現(xiàn)紫色,在578nm處有最大吸收光.當(dāng)體系中產(chǎn)生的·OH與甲基紫發(fā)生親電加成反應(yīng)時(shí)，·OH容易進(jìn)攻甲基紫的-C=C-基團(tuán)，二者產(chǎn)生反應(yīng)使甲基紫褪色，導(dǎo)致甲基紫的吸光值降低.如果向體系中加入真菌多糖后，體系的顏色有所加深，測(cè)得的光吸收值增加，說(shuō)明·OH減少，體系中的親電加成反應(yīng)減弱，游離的甲基紫增多.因此可利用加入真菌多糖前后溶液吸光度值、顏色的變化來(lái)評(píng)價(jià)所加入的真菌多糖是否對(duì)·OH有清除作用，并通過(guò)清除率的大小來(lái)判斷和比較真菌多糖清除能力的強(qiáng)弱.

1.1.4 EDTANa2-Fe2+-H2O2-番紅體系法[12]

EDTANa2-Fe2+-H2O2-番紅體系中的番紅在519nm處有最大光吸收值，體系中產(chǎn)生的羥自由基可特異地使番紅褪色.向該體系中加入某一種真菌多糖后，根據(jù)多糖加入前后光吸收值變化來(lái)判斷羥自由基是否被清除.以計(jì)算的清除率判斷真菌多糖對(duì)羥自由基的清除能力.

1.2 真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基（O2-.）清除作用研究的方法

真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用研究的方法日前有報(bào)道的是:“鄰苯三酚自氧化法”,“氮藍(lán)四唑(NBT)光照法”,“PMS-NADH體系還原NBT法”,“腎上腺素自氧化法”,“黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶法,堿性二甲基亞砜發(fā)光法”.資料顯示，研究中多采用的是“鄰苯三酚自氧化法”.

1.2.1 鄰苯三酚自氧化法[13]

鄰苯三酚在弱堿性條件下可發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-·），該自由基可生成帶色的中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物在325nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)烈的光吸收能力.光吸收值的大小伴隨著中間產(chǎn)物數(shù)量的積累而增加.并且在反應(yīng)初始的4min范圍內(nèi)，光吸收值的大小與反應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系.根據(jù)鄰苯三酚自氧化特性，構(gòu)建自氧化反應(yīng)體系，在4min內(nèi)，每間隔30s測(cè)定一次光吸收值并加以記錄.以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，求直線方程，計(jì)算自氧化速率（每分鐘光吸收值變化）.以同樣的方法測(cè)定并計(jì)算加入一定濃度多糖后的自氧化速率.如果向自氧化體系中加入某一種真菌多糖后，測(cè)得的光吸收值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，說(shuō)明體系中超氧陰離子自由基（O2-·）減少.證明真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基具有清除作用.清除率的大小判斷其清除能力.

1.2.2 氮藍(lán)四唑(NBT)光照法[14]

NBT-光照法體系中，核黃素和四甲基乙二胺在光照條件下可產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-·），氮藍(lán)四唑(NBT)與O2-·反應(yīng)生成單甲腙（黃色），繼而還原生成二甲腙，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm下有最大光吸收.加入超氧陰離子自由基（O2-·）清除劑時(shí)，可以使超氧陰離子自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲腙生成速度減慢.故可以通過(guò)測(cè)定560nm處值和顏色的變化來(lái)評(píng)價(jià)清除劑對(duì)（O2-·）的清除作用.如果所加入的清除劑用真菌多糖來(lái)代替，并有同樣的現(xiàn)象與變化，說(shuō)明真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）有清除作用.

1.2.3 PMS-NADH體系還原NBT法[15]

N-甲基吩嗪甲基硫酸鹽（PMS）-還原性輔酶Ⅰ（NADH）體系中，NADH氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基還原氮藍(lán)四唑（NBT）為藍(lán)色物質(zhì)，該物質(zhì)在560nm波長(zhǎng)處有最大光吸收值.依據(jù)該原理構(gòu)建由磷酸緩沖液（0.1mol.L-1,pH7. 4）、NADH、PMS、NBT組成的PMS-NADH體系，在室溫下反應(yīng)一定時(shí)間，使體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基還原NBT生成藍(lán)色物質(zhì)，測(cè)藍(lán)色生成物的光吸收值.如果向體系中加入一定量的真菌多糖，所測(cè)得的光吸收值低于未加多糖前體系所測(cè)得的光吸收值，說(shuō)明藍(lán)色生成物減少，體系中生成的超氧陰離子自由基被加入的真菌多糖在不同程度上被清除.根據(jù)光吸收值的變化計(jì)算真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，以判斷其清除能力.

圖1 銀耳多糖對(duì)羥自由基的清除作用

圖2 靈芝多糖對(duì)羥自由基的清除作用

圖3 銀耳多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

研究表明在鄰苯三酚自氧化體系中加入不同濃度的真菌多糖，其多糖對(duì)體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基具有清除作用.顏軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)銀耳多糖對(duì)超氧陰離子自由基的數(shù)為0.9816.當(dāng)銀耳多糖對(duì)羥自由基的清除率達(dá)50%時(shí)，所需的多糖濃度為0.116mg.mL-1.周海華，馬海樂(lè)[17]采用同樣的方法研究云芝多糖發(fā)現(xiàn)在1-5 mg.mL-1濃度范圍內(nèi)對(duì)羥自由基的最大清除率是48.55%.

張鈺，章克昌[18]對(duì)超濾濃縮法提取的靈芝多糖采用Fenton反應(yīng)體系研究靈芝多糖對(duì)羥自由基的清除作用，研究結(jié)果（見(jiàn)圖2）表明，靈芝多糖對(duì)羥自由基具有清除作用，相關(guān)系數(shù)為0.9359.量效關(guān)系較好.清除率達(dá)50%時(shí)的靈芝多糖濃度為1.561mg.ml-1

李海平等[19]研究表明滑菇多糖對(duì)羥基自由基（·OH）具清除作用，滑菇多糖（PNP）對(duì)·OH的EC50時(shí)的多糖濃度為0.14 mg.mL-1；王宗君[20]等研究表明茶樹(shù)菇多糖也具有清除· OH的作用，且在一定范圍內(nèi)清除率與多糖的用量存在一定的量效關(guān)系.在低濃度時(shí)，隨著濃度的增加，清除率有顯著提高，當(dāng)0.5%多糖的濃度清除率就可以達(dá)到74.9%；1.0%多糖濃度清除率達(dá)到將近90%；其后再增加多糖的濃度，對(duì)· OH的清除率提高不大.

2.2 不同真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

2 不同真菌多糖對(duì)氧自由基的清除作用

2.1 不同真菌多糖對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

顏軍等[16]，采用H2O2-Fe2+-水楊酸反應(yīng)體系研究真菌多糖對(duì)羥自由基的清除作用發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖對(duì)羥自由基具有清除作用.清除能力隨著銀耳多糖濃度的增加而增加.將其試驗(yàn)結(jié)果作直線圖，表明：在所設(shè)定的銀耳多糖濃度范圍內(nèi)，多糖濃度與清除率呈良好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖1），相關(guān)系清除能力隨著銀耳多糖濃度的增加而增加，在所設(shè)定的銀耳多糖濃度范圍內(nèi)，多糖濃度與清除率呈良好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖3）.當(dāng)銀耳多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)50%時(shí)，所需的多糖濃度為0.264mg.mL-1.

秦恩華[21]研究表明：茶薪菇多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基也具有清除作用.清除能力隨著茶新菇多糖濃度的增加而增加，在0.1-0.9mg.mL-1濃度范圍內(nèi)，多糖濃度與清除率呈良好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖4）.其清除率達(dá)50%時(shí)所需茶新菇多糖濃度是1.515 mg.mL-1.

圖4 茶薪菇多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

周海華，馬海樂(lè)[22]在NADH-PMS-NBT體系中加入不同濃度的云芝多糖，其多糖對(duì)體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有清除作用，在0.01-0.1mg.mL-1濃度范圍內(nèi)，云芝多糖濃度與清除率呈良好的正相關(guān).對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)50%時(shí)所需要的多糖濃度為0.0952 mg.mL-1.

3 不同真菌多糖對(duì)氧自由基清除能力的比較

3.1 不同真菌多糖對(duì)羥自由基清除能力的比較

盛偉等[23]采用H2O2-Fe2+-水楊酸反應(yīng)體系對(duì)白靈菇、杏鮑菇和阿魏菇三種真菌多糖對(duì)羥自由基的清除作用進(jìn)行了研究.研究結(jié)果表明：三種真菌多糖對(duì)羥自由基均有清除作用，清除能力與多糖濃度也呈量效關(guān)系.在相同的濃度條件下，白靈菇對(duì)羥自由基的清除作用明顯高于杏鮑菇和阿魏菇.三種真菌多糖在所研究的濃度范圍內(nèi)，均在0.25 mg. mL-1時(shí)表現(xiàn)出最大清除率，分別是48%、31.5%、25%左右.證明三種真菌多糖對(duì)羥自由基的清除能力不同，清除能力按其大小依次為白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇.

魏磊等[24]對(duì)野生的雞油菌、變綠紅菇、蜜環(huán)菌、棕灰口蘑四種野生食用菌多糖對(duì)羥自由基的清除作用的研究發(fā)現(xiàn)，四種野生食用菌對(duì)羥自由基都有很好的清除能力，10mg. mL-1時(shí)清除率最大，均達(dá)到95%以上.其中雞油菌達(dá)到99.60%.清除率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的四種野生食用菌的多糖濃度依次為1.12、1.21、0.78、0.65mg.mL-1.清除能力大小依次為棕灰口蘑、蜜環(huán)菌、雞油菌、變綠紅菇.

表1 四種真菌多糖對(duì)羥自由基清除能力比較

孫娟等[10]對(duì)美味牛肝菌、羊肚菌、松茸及印度塊菌四種珍稀食用菌粗多糖對(duì)羥自由基清除作用的研究表明，四種珍稀食用菌對(duì)羥基自由基均有很好的清除作用，其中美味牛肝菌多糖濃度與清除率二者呈正相關(guān).四種珍稀食用菌粗多糖對(duì)羥自由基的最大清除率及所對(duì)應(yīng)的多糖濃度不同（見(jiàn)表1）.

陶明煊等[25]研究表明，金頂側(cè)耳、姬菇和毛頭鬼傘三種真菌粗多糖對(duì)羥自由基均具有清除作用.三種真菌粗多糖清除率達(dá)50%時(shí)，所需的濃度分別為2.45、2.60 mg.mL-1和2.59 mg.mL-1.

李芳亮[26]等研究表明香菇多糖（WPLT）和褐蘑菇多糖（WPPA）分級(jí)醇沉獲取的多糖對(duì)·OH均具有清除作用，并呈較好的量效關(guān)系，它們都隨濃度的增加對(duì)·OH的清除率增強(qiáng).WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80在0.05-1mg.mL-1范圍內(nèi)，清除·OH自由基有較好的量效關(guān)系.清除·OH的能力從大到小依次是：WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50.WPPA80、WPPA50和WPLT80的EC50分別為0.32、0.60、0.70 mg.mL-1；

以對(duì)羥自由基清除能力為50%時(shí)所需的多糖濃度（Ec50）為標(biāo)準(zhǔn)，不同真菌多糖對(duì)羥自由基的清除能力比較（見(jiàn)表2）.

表2 真菌多糖對(duì)羥自由基清除能力的比較

3.2 不同真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的比較

盛偉等[23]研究表明，白靈菇、杏鮑菇和阿魏菇對(duì)超氧陰離子自由基均具有清除作用，且呈量效關(guān)系.在所研究的濃度范圍內(nèi)，三種真菌多糖濃度均在0.25mg.mL-1時(shí)表現(xiàn)出最大清除率，分別是52.97%、44.16%、42.56%.證明三種真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力不同，清除能力按其大小依次為杏鮑菇、白靈菇、阿魏菇.

陶明煊等[25]研究表明，金頂側(cè)耳、姬菇和毛頭鬼傘三種真菌粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基均具有清除作用.三種真菌粗多糖清除率達(dá)50%時(shí)，所需的濃度分別為0.32、0.36mg. mL-1和0.3mg.mL-1.

李芳亮[26]等研究表明香菇多糖（WPLT）和褐蘑菇多糖（WPPA）對(duì)O2-·具有清除作用,不同濃度乙醇醇沉獲取的多糖對(duì)O2-·清除能力不同.在0.05-1 mg.mL-1的范圍內(nèi)，清除O2-·自由基具有量效關(guān)系.它們都隨濃度的增加，對(duì)O2-·的清除率明顯增強(qiáng).它們對(duì)O2-·的清除能力從大到小依次是：WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50.經(jīng)計(jì)算WPPA80和WPPA50的EC50分別為0.52 mg.mL-1和0.82 mg.mL-1.

幾種真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力比較（見(jiàn)表3）.

表3 真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的比較

4 小結(jié)

綜上所述，科學(xué)合理的構(gòu)建產(chǎn)生超氧陰離子自由基和羥自由基的體系，是研究某物質(zhì)是否對(duì)自由基有清除作用的體系保證，清除率的大小是評(píng)價(jià)某物質(zhì)對(duì)自由基是否有清除作用及清除能力大小的指標(biāo).

許多試驗(yàn)研究已證明：真菌多糖對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基具有良好的清除作用.在一定的濃度范圍內(nèi)，真菌多糖濃度與多糖對(duì)氧自由基的清除率呈良好的量效關(guān)系，且隨著多糖濃度的增加，清除率升高.不同真菌多糖表現(xiàn)的量效關(guān)系所處的濃度范圍不同.在良好的量效關(guān)系下，以清除率達(dá)50%所需的真菌多糖濃度來(lái)判斷不同真菌多糖對(duì)氧自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)不同真菌多糖對(duì)氧自由基的清除能力不同.清除率達(dá)50%時(shí)所需的真菌多糖濃度愈低，清除能力相對(duì)愈高.目前研究已知，銀耳多糖、滑菇多糖、靈芝多糖、金頂側(cè)耳、毛頭鬼傘、姬菇六種真菌多糖對(duì)羥自由基的清除能力由大到下依次為銀耳多糖＞滑菇多糖＞靈芝多糖＞金頂側(cè)耳＞毛頭鬼傘＞姬菇.在已研究的六種真菌多糖中對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力由大到下依次為云芝多糖＞銀耳多糖＞毛頭鬼傘＞金頂側(cè)耳＞姬菇＞茶薪菇.

5 展望

研究表明，人體內(nèi)過(guò)量的自由基，會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA鏈斷裂、細(xì)胞解體等現(xiàn)象的發(fā)生.并證明了人體的衰老，腫瘤、心血管疾病的發(fā)生等與體內(nèi)存在過(guò)量的自由基有關(guān).因此尋找有效的抗氧化劑具有重要意義.食用菌作為食品和藥用成分在我國(guó)已有悠久應(yīng)用歷史，它們不僅有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且富含多糖.真菌多糖是一類(lèi)重要的保健功能因子,并且多糖是生物有機(jī)體中繼蛋白質(zhì)、核酸之外的第三大生物大分子,多糖具有多種生物活性.真菌多糖的抗氧化活性，這預(yù)示著它在醫(yī)學(xué)及人類(lèi)保健事業(yè)上有潛在的利用價(jià)值，近些年對(duì)食用菌氧自由基和天然抗氧化劑的研究，已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)界研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn).食用菌展現(xiàn)出其廣闊的應(yīng)用前景，食用菌天然抗氧化劑必將為人類(lèi)的健康做出巨大的貢獻(xiàn).

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