鄭苗苗，池玉杰

(1 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006;2 東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

漆酶(Laccase)是一種多酚氧化酶，一般含有4 個(gè)銅原子，分布于3 個(gè)高度保守的不同結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)銅原子在催化機(jī)制中都有很重要的作用.漆酶能催化O2通過(guò)4 個(gè)電子還原成水，并且伴隨著一些酚類(lèi)底物的氧化［1］.漆酶最早是由日本的吉田于1883年在漆樹(shù)的分泌物中發(fā)現(xiàn)，隨后1893年Laborde 又證實(shí)在一些真菌中也含有這種酶.到目前為止，發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于真菌和植物中，而且某些昆蟲(chóng)、細(xì)菌當(dāng)中也含有漆酶［2］.其中，真菌中的白腐菌類(lèi)含有漆酶最多，研究也最為廣泛.近120 多年來(lái)，漆酶一直是生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中十分活躍的研究熱點(diǎn)［3］.

真菌漆酶存在很多同工酶基因，由于菌株的生長(zhǎng)環(huán)境和生理狀態(tài)不同其表達(dá)量也不同［4］.多項(xiàng)研究表明，受金屬離子、營(yíng)養(yǎng)元素和小分子芳香化合物影響，漆酶基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)較低［5］.由于轉(zhuǎn)錄本的增加主要是由轉(zhuǎn)錄模板上游的啟動(dòng)子及其相關(guān)順式作用元件發(fā)揮作用后直接引發(fā)的，從而影響了漆酶的表達(dá)量［6］.因此，研究真菌漆酶基因轉(zhuǎn)錄控制區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)于提高漆酶蛋白的表達(dá)產(chǎn)量以及在異源表達(dá)中提高漆酶活性至關(guān)重要.本文通過(guò)RTPCR、RACE 技術(shù)和SEFA-PCR 方法相結(jié)合，從偏腫革裥菌Lenzites gibbosa 中獲得編碼漆酶基因的cDNA、Genomic DNA 的全長(zhǎng)序列及啟動(dòng)子序列，并且對(duì)其序列進(jìn)行了分析，它們?cè)贕enBank 上的登錄號(hào)為JF817353 和JF906787.

1 材料與方法

1．1 菌株與試劑

偏腫革裥菌菌株采集于黑龍江省涼水國(guó)家自然保護(hù)區(qū)，由東北林業(yè)大學(xué)鑒定并保存.DNAquick_快捷型植物基因組DNA 提取系統(tǒng)、DNAquick Plant System 均為T(mén)IANGEN 公司產(chǎn)品;E.Z.N.A 真菌RNA 提取試劑盒、E.Z.N.A 凝膠回收試劑盒均為OMEGA 公司產(chǎn)品;Genome Walking Kit 試劑盒、兩步法RT-PCR 試劑盒、3'RACE試劑盒均為T(mén)aKaRa 公司產(chǎn)品;SMART RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒為Clontech 公司產(chǎn)品;Escherichia coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;pMD20-T Vector、LA Taq DNA 聚合酶為Promega 公司產(chǎn)品;其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1．2 基因組DNA 和總RNA 提取

以陳軍等［7］報(bào)道的優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基培養(yǎng)偏腫革裥菌.提取偏腫革裥菌基因組DNA 和總RNA，產(chǎn)物用核酸檢測(cè)儀測(cè)定純度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)完整性.

1．3 cDNA 核心片段克隆

合成cDNA 第1 鏈參照兩步法RT-PCR 試劑盒使用說(shuō)明.在GenBank 中選取20 條不同漆酶全長(zhǎng)基因的氨基酸序列，根據(jù)比對(duì)結(jié)果查找出同源序列保守區(qū)，從而設(shè)計(jì)1 對(duì)簡(jiǎn)并引物(表1)，PCR 反應(yīng)體系25 μL，含10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS(5 U/μL)0.5 μL，引物L(fēng)cc-RT1 和Lcc-RT2 各0.5 μL，cDNA 1 μL.反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;然后以94 ℃30 s，55 ℃30 s，72℃2 min 進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);于72 ℃延伸10 min，取3 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定(以下檢測(cè)方法相同).

表1 擴(kuò)增漆酶cDNA 序列和基因組序列引物Tab．1 Primers for amplifying the laccase gene fragment

1．4 漆酶cDNA3'/5'末端的RACE-PCR 擴(kuò)增

參照3'RACE 試劑盒和SMART RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒使用說(shuō)明合成cDNA，根據(jù)漆酶cDNA 基因片段序列，設(shè)計(jì)3'/5'RACE 特異性引物(表1)，從而獲得漆酶cDNA 基因的3'/5'末端序列.cDNA3'末端套式PCR 反應(yīng)體系25 μL，第1 次PCR 反應(yīng)含10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1 μL，1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ1 μL，3' RACE Outer Primer(10 μmol/L)1 μL，TaKaRa LA Taq?(5 U/μL)1 μL，Gene Specific Outer Primer(10 μmol/L)1 μL，cDNA 1 μL.反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，20 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸15 min.第2 次PCR 反應(yīng)含10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Free)2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL，Gene Specific Inner Primer(10 μmol/L)1 μL，3' RACE Inner Primer(10 μmol/L)1 μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)0.25 μL，1st PCR 產(chǎn)物0.5 μL.反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸15 min.cDNA5'末端套式PCR 反應(yīng)體系25 μL，10×Advantage2 PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)0.5 μL，50×Advantage2 polymerase Mixture 0.5 μL，5' RACE-Ready cDNA 1.5 μL，GSP1(10 μmol/L)0.5 μL，UPM(10×)2.5 μL.反應(yīng)條件同3' RACE.

1．5 漆酶cDNA 全長(zhǎng)及Genomic DNA 全長(zhǎng)的擴(kuò)增

根據(jù)cDNA 3'/5'末端測(cè)序的結(jié)果，分別在其5'末端和3'末端設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，用于擴(kuò)增漆酶cDNA 全長(zhǎng).同時(shí)，以基因組DNA 為模板，擴(kuò)增漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng).cDNA 全長(zhǎng)PCR 反應(yīng)體系50 μL，含5×Prime STARTMBuffer(Mg2+Plus)10 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)4 μL，Prime STARTMHS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，引物L(fēng)cc2-S1 和Lcc2-S2 各1 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 5 μL.Genomic DNA全長(zhǎng)PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.3.

1．6 SEFA-PCR 法克隆漆酶基因的啟動(dòng)子序列

根據(jù)已獲得的漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)5'端啟動(dòng)子特異性引物，分別為:Lcc2-SP1、Lcc2-SP2、Lcc2-SP3(表1)，以基因組DNA 為模板進(jìn)行3輪PCR 擴(kuò)增，獲得漆酶基因5'端啟動(dòng)子序列.

1．7 漆酶基因結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析

將上述獲得的漆酶cDNA 全長(zhǎng)和漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)以及漆酶基因的啟動(dòng)子序列經(jīng)過(guò)純化試劑盒回收后，進(jìn)行T 載體克隆，并送交生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序.應(yīng)用相關(guān)生物學(xué)軟件對(duì)獲得的漆酶cDNA 序列和漆酶基因組序列以及漆酶基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行相似性比較及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析.

2 結(jié)果與分析

2．1 偏腫革裥菌漆酶cDNA 的克隆與序列分析

根據(jù)真菌漆酶基因保守的Cu-bind 結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅳ氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增漆酶cDNA 核心片段，獲得1 條約1 200 bp 基因片段，將其進(jìn)行T 載體克隆并測(cè)序，結(jié)果得到大小為1 185 bp 的基因片段，其序列與GenBank 中序列Blastn 比對(duì)后得知其為漆酶基因片段(圖1).根據(jù)獲得的漆酶cDNA 核心片段的3'端保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性正向引物，以此引物擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄的3'RACE cDNA，獲得一大小約500 bp 條帶，將其純化后進(jìn)行測(cè)序，獲得基因片段為390 bp，其3'端有典型的PolyA 尾巴，在PolyA 尾前有一加尾信號(hào)(AATAAA)(圖2).將該序列輸入到Gen-Bank 中Blastx 比對(duì)后確認(rèn)其與漆酶基因具有很高的相似性.根據(jù)獲得的漆酶cDNA 核心片段5'端保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性反向互補(bǔ)引物，以此引物擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄的5'RACE cDNA，獲得一大小約750 bp 條帶，將其純化后測(cè)序，獲得片段為753 bp，5'端有一非編碼區(qū)(1～73 bp)，編碼區(qū)的長(zhǎng)度為698 bp，該序列與RT-PCR 擴(kuò)增的片段有重復(fù)區(qū)域，且將該序列輸入到GenBank 中Blastx 比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與漆酶基因具有很高的相似性(圖3).

圖1 偏腫革裥菌漆酶基因的RT-PCR 結(jié)果Fig.1 RT-PCR products of laccase gene from Lenzites gibbosa

圖2 偏腫革裥菌漆酶基因的3' RACE Outer PCR 和3'RACE Inner PCR 結(jié)果Fig.2 3' RACE Outer PCR and Inner PCR of laccase gene from Lenzites gibbosa

圖3 偏腫革裥菌漆酶基因的5'RACE-PCR 結(jié)果Fig.3 5'RACE-PCR of laccase gene from Lenzites gibbosa

根據(jù)RT-PCR 獲得的漆酶基因片段與3'/5'RACE 獲得的漆酶基因片段具有重復(fù)區(qū)域，剪切拼接后得到一全長(zhǎng)為1 563 bp 的漆酶基因，命名為L(zhǎng)g-lac2.該漆酶基因cDNA 序列在GenBank 上的登錄號(hào)為JF817353.漆酶基因具有真核基因的一般特征:在其5'端有一非編碼區(qū)，長(zhǎng)度為73 bp;3'端有一典型的PolyA 尾巴和一加尾信號(hào)(AATAAA).通過(guò)NCBI 的ORF Finder 查找到1 條長(zhǎng)1 563 bp 的完整開(kāi)放式閱讀框(Open reading frame，ORF)，從第95～1 637 bp 的核苷酸片段的相對(duì)分子質(zhì)量約為53 900，等電點(diǎn)(pI)約為5.65，限制性酶切位點(diǎn)有68 個(gè)，其編碼520 個(gè)氨基酸.利用SignalP V2.0 軟件分析編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其N(xiāo) 端包括一典型信號(hào)肽序列(1～21 氨基酸)，剪切位點(diǎn)為VVG-AI.通過(guò)應(yīng)用Scanprosite 程序可得出在漆酶基因編碼的氨基酸序列中含有8 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-X-S/T)，天冬酰胺殘基分別位于氨基酸序列的第54、141、208、217、251、333、341、436 位，它們都是潛在的糖基化位點(diǎn).應(yīng)用RPS-Blast 進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白有3 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:即pfam07732、pfam07731 和pfam00394，其中pfam07732 和pfam07731 是多銅氧化酶中與次級(jí)代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)域;第3 個(gè)pfam00394 是銅氧化酶(Cu-oxidase)的保守結(jié)構(gòu)域(圖4).將漆酶基因編碼的氨基酸序列與GenBank 中登錄的蛋白序列進(jìn)行Blastp 比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，它與其他真菌漆酶基因編碼的氨基酸序列具有較高的相似性.其中與彩絨革蓋菌Trametes versicolor 的氨基酸序列相似性評(píng)價(jià)最高，相似性達(dá)83%，與變色栓菌Trametes sp.I-62、栓菌Trametes sp.48424、靈芝Ganoderma lucidum 的漆酶基因序列相似性達(dá)到72%～81%.

2．3 漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)的獲得與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)漆酶cDNA 的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，以基因組DNA 為模板通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得該漆酶Genomic DNA 的全長(zhǎng)序列(圖5)，長(zhǎng)度為2 165 bp，命名為L(zhǎng)g-lac2'.該序列在GenBank 中的登錄號(hào)為JF906787.

通過(guò)比較漆酶基因的cDNA 和Genomic DNA 全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)該漆酶基因包含11 個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子.內(nèi)含子的長(zhǎng)度分別為56、53、64、51、53、59、58、57、67 和84 bp，是典型的真菌內(nèi)含子的長(zhǎng)度(49～85 bp)［3］.內(nèi)含子中剪切位點(diǎn)的特征序列為5'-GT…AG-3'(圖4).

2．4 漆酶基因啟動(dòng)子的獲得與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析

根據(jù)漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)序列信息，參照Liu等［8］的方法，靠近5'端設(shè)計(jì)3 條反向引物L(fēng)cc2-SP1、Lcc2-SP2 和Lcc2-SP3，以偏腫革裥菌基因組DNA 為模板對(duì)該基因上游片段進(jìn)行hiTAIL-PCR 擴(kuò)增.3 輪反應(yīng)后，引物L(fēng)cc2-SP1、Lcc2-SP2 和Lcc2-SP3 獲得了較長(zhǎng)的PCR 產(chǎn)物(圖6).對(duì)第2 輪PCR 中的Lcc2-SP2 和AP2 引物產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序，獲得了總長(zhǎng)度1 500 bp 的序列信息，分析發(fā)現(xiàn)該序列包括了漆酶基因5'末端及其上游.

利用Softberry 網(wǎng)站的Recognition of regulatory motifs with statistic 和Promoter prediction 對(duì)所克隆得到的Lg-Lac2'啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析.在所克隆的Lg-Lac2'啟動(dòng)子序列中，5' 端上游包含了真核生物啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，Lg-lac2'的啟動(dòng)子序列中存在許多潛在的外源誘導(dǎo)物響應(yīng)結(jié)合元件:2 個(gè)CAAT框，分別位于第-702、-776 位;5 個(gè)AP2 元件，位于第-119、-173、-348、-365、-731 位;1 個(gè)熱擊元件(CreA)(SYGGRG)，位于第-697 位;2 個(gè)潛在的壓力響應(yīng)元件(STRE)(CCCCT/AGGGG)，分別位于第-38、-247 位;1 個(gè)潛在的熱擊響應(yīng)元件(HSEs)(TCNNGAAN)，位于第-23 位;1 個(gè)異生物質(zhì)反應(yīng)元件(XRE)(CACGCW)，位于第-306 位;7 個(gè)氮因子結(jié)合位點(diǎn)(GATA)或其互補(bǔ)序列(TATC)，分別位于第-81、-112、-154、-218、-579、-779、-842 位;3 個(gè)金屬應(yīng)答元件(MRE)(TGCRCNG)，分別位于第-426、-451、-629 位;1 個(gè)ACE 作用元件，位于第-468位;1 個(gè)NIT2 元件，位于第-154 位［9-10］(圖4).

根據(jù)Lg-lac2 的Genomic DNA 全長(zhǎng)序列的內(nèi)含子及外顯子的大小以及啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度不同，在一定程度上與其他真菌進(jìn)行比較.結(jié)果表明，Lg-lac2的TⅠ、TⅢ、TⅣ、TⅥ和TⅦ內(nèi)含子與其他種相同，TⅡ、TⅤ和TⅧ內(nèi)含子除Flammol/Lulina velutipes 較大外，其他幾個(gè)種與Lg-lac2 相同，TⅨ和TⅩ內(nèi)含子Lg-lac2 與其他真菌都有所不同.啟動(dòng)子序列以及3'非翻譯區(qū)序列的長(zhǎng)度各種間也有所不同(圖7).由此可見(jiàn)，不同種類(lèi)真菌的漆酶基因結(jié)構(gòu)不同，從而導(dǎo)致漆酶基因的功能以及漆酶基因的表達(dá)調(diào)控也各不相同.

2．5 偏腫革裥菌漆酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

漆酶是一個(gè)具有重要生物學(xué)功能的酶，其在真菌、植物和動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中起著不可忽視的作用［11-12］.因此根據(jù)它的氨基酸變異情況可在一定程度上了解物種進(jìn)化的規(guī)律.用Treeview 對(duì)白腐菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果明顯包括3 部分，分別是多孔菌Polyporales、傘菌Agaricales 和子囊菌Ascomycota.本文中的漆酶基因?qū)儆诙嗫拙?，其中與Trametes versicolor 漆酶基因在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中遺傳距離最近，相似性評(píng)價(jià)最高.從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也可看出，同一物種漆酶基因不同的同工酶之間遺傳距離也存在著差異(圖8).

圖4 Lg-lac2 基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the Lg-lac2 gene

圖5 偏腫革裥菌漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)的PCR 結(jié)果Fig.5 PCR products of laccase gene from Lenzites gibbosa

圖6 偏腫革裥菌漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)5'啟動(dòng)子hiTAILPCR 擴(kuò)增Fig.6 HiTAIL-PCR products of 5'promoter of laccase gene from Lenzites gibbosa

圖7 白腐真菌漆酶Genomic DNA 全長(zhǎng)、啟動(dòng)子及3'非翻譯區(qū)序列比對(duì)Fig.7 Comparison of promoter lengths and intron distribution for the novel Lenzites gibbosa laccase genes and other six selected fulllength sequences with higher or lower homologous laccases from six white-rot fungi

圖8 Lg-lac2 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.8 Phylogenetic tree of Lg-lac2 gene

3 討論與結(jié)論

對(duì)偏腫革裥菌漆酶同工酶基因啟動(dòng)子的克隆，有助于對(duì)偏腫革裥菌漆酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究.同時(shí)，作為在偏腫革裥菌中克隆的可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，也為在偏腫革裥菌中構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)載體提供了物質(zhì)基礎(chǔ).另外，在偏腫革裥菌漆酶基因啟動(dòng)子的5'端調(diào)控區(qū)域，還分布有1 個(gè)潛在的熱擊響應(yīng)元件(HSEs)和2 個(gè)潛在的壓力響應(yīng)元件(STRE).Faraco 等［2］在酵母菌Pichia pastoris 中證明，HSEs 能夠感受外界強(qiáng)烈熱刺激從而激活金屬硫蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，因而HSEs 和STRE 可能會(huì)共同響應(yīng)高濃度Cu2+的壓力而激活偏腫革裥菌漆酶基因的轉(zhuǎn)錄.Marzluf［6］的研究也表明，在酵母菌、粗糙脈孢菌Neurospora crassa 等真菌中，特異的氮因子結(jié)合元件(GATA)能夠激活氮結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄.而本文在所克隆的偏腫革裥菌漆酶基因啟動(dòng)子序列上也分析到有7 個(gè)潛在的氮因子結(jié)合位點(diǎn)，這說(shuō)明偏腫革裥菌漆酶基因還可能受到N 源的調(diào)控.

綜上所述，本文利用RT-PCR、RACE 技術(shù)和SEFA-PCR 方法在偏腫革裥菌菌株中獲得1 個(gè)新的漆酶基因cDNA 和Genomic DNA 的全長(zhǎng)序列以及漆酶基因啟動(dòng)子序列.這對(duì)于今后研究漆酶基因在偏腫革裥菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所起的生物學(xué)作用和進(jìn)行基因遺傳操作具有重要的意義.

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