鄭紅玉，黃毓茂，余希堯，鐘澤民，項(xiàng)林盛，唐麗云

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

絲狀真菌在自然界的土壤、有機(jī)廢物、動(dòng)植物細(xì)胞中普遍存在，這類真菌能夠分泌大量不同種類的代謝產(chǎn)物和酶類，使其可以充分利用周圍的有機(jī)成分作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，高效完成自身生命過(guò)程［1-2］.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的絲狀真菌作為表達(dá)宿主用于生產(chǎn)外源蛋白［3-4］.包括黑曲霉在內(nèi)的多種絲狀真菌，就是由于具有極強(qiáng)的活性蛋白分泌能力以及蛋白質(zhì)翻譯后加工能力，成為工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中極具吸引力的代表［5-6］.通過(guò)各種條件的優(yōu)化，黑曲霉自身糖化酶產(chǎn)量甚至達(dá)到了30 g/L［7］.

作為表達(dá)宿主，雖然絲狀真菌已經(jīng)成功表達(dá)多種外源蛋白，但是大部分非真菌蛋白的產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求［8］.研究者已經(jīng)采用了多種方法來(lái)提高異源蛋白的產(chǎn)量，包括使用強(qiáng)啟動(dòng)子［9］、增加目的基因的拷貝數(shù)［10-11］、密碼子優(yōu)化［12］、融合策略［13］、應(yīng)用蛋白酶缺陷菌株、引入內(nèi)含子［14］、引入糖基化相關(guān)基因、優(yōu)化發(fā)酵條件［15-17］等.本試驗(yàn)采用強(qiáng)啟動(dòng)子PglaA，應(yīng)用融合策略成功構(gòu)建了黑曲霉表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證了表達(dá)系統(tǒng)的正確性，同時(shí)清晰地觀察到了蛋白在菌絲水平的分泌特點(diǎn)，為其他目的基因在黑曲霉中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑曲霉糖化酶生產(chǎn)菌株，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;大腸埃希菌DH5α 購(gòu)自廣州佰思公司;質(zhì)粒sGFP 和pEN51 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室保存，sGFP 含有潮霉素抗性基因和色氨酸基因終止子，pEN51 含有EGFP 基因;rTaq DNA 聚合酶，LA Taq DNA 聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、AvrⅡ、XhoⅠ、AflⅡ、HindⅢ、SpeⅠ、ApaⅠ、NotⅠ，T4 DNA 連接酶，pUC19 質(zhì)粒，pMD-18 T 載體，DNA Marker 為大連寶生物工程公司(TaKaRa)產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒，DNA 膠回收試劑盒，DNA 純化試劑盒為Omiga 公司產(chǎn)品;潮霉素B、氨芐青霉素為廣州鼎國(guó)公司產(chǎn)品.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR 引物的設(shè)計(jì)與序列擴(kuò)增 從GeneBank中分別查找黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子(PglaA X00712)，色氨酸基因終止子序列(TtrpC)，糖化酶基因序列，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白序列(EGFP).根據(jù)序列信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增TtrpC、EGFP 和PglaA-g(糖化酶啟動(dòng)子和糖化酶前498 個(gè)氨基酸基因);其中PglaA-g 基因中含有糖化酶基因信號(hào)肽序列和KEX2 多肽酶切割位點(diǎn).同時(shí)，根據(jù)質(zhì)粒sGFP 的序列信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增潮霉素抗性基因(PHT).所設(shè)計(jì)引物都含有不同的酶切位點(diǎn)，用于各個(gè)片段的連接，其中PglaA-g 下游引物中含有4 個(gè)酶切位點(diǎn)XhoⅠ、NotⅠ、ApaⅠ和SpeⅠ，作為多克隆位點(diǎn)，用于引入目的基因.另外，設(shè)計(jì)檢測(cè)引物用于轉(zhuǎn)化后黑曲霉陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定，上游引物位于糖化酶基因中，下游引物位于EGFP 基因中，以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組為模板可以擴(kuò)增到1 700 bp 左右的片段.以上設(shè)計(jì)的全部引物序列見(jiàn)表1.

表1 PCR 引物設(shè)計(jì)Tab.1 Design of PCR primers

1.2.2 EGFP 分泌表達(dá)載體的構(gòu)建 將TtrpC 的PCR 產(chǎn)物通過(guò)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切與質(zhì)粒pUC19連接，得到中間質(zhì)粒pUC19-TtrpC;pUC19-TtrpC 與PglaA-g 通過(guò)AvrⅡ、XhoⅠ雙酶切后連接，獲得質(zhì)粒pUC19-PglaA-g-TtrpC;pUC19-PglaA-g-TtrpC 再與PHT的PCR 產(chǎn)物通過(guò)AflⅡ、HindⅢ雙酶切連接，得到骨架質(zhì)粒pPHT;將EGFP 基因質(zhì)粒通過(guò)SpeⅠ、XhoⅠ雙酶切與質(zhì)粒pPHT 連接，最終得到黑曲霉表達(dá)載體pPHT-EGFP，載體質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程如圖1 所示.

1.2.3 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑曲霉 接種黑曲霉孢子于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中(使孢子濃度達(dá)到106mL-1)，振蕩培養(yǎng)(30℃，150 r/min)14 h，用混合酶解液(在5 mL 高滲溶液中加入0.05 g 溶壁酶、0.05 g 蝸牛酶、0.025 g 溶菌酶，充分溶解后，離心，過(guò)濾除菌)懸浮適量菌絲，振蕩酶解(34℃、100 r/min)3 h，當(dāng)大量原生質(zhì)體生成時(shí)，用過(guò)濾器過(guò)濾收集原生質(zhì)體，然后用聚乙二醇/氯化鈣方法進(jìn)行外源DNA 的轉(zhuǎn)化試驗(yàn).

圖1 黑曲霉分泌表達(dá)載體pPHT-EGFP 的構(gòu)建(PHT:PgpdA-HygR-TtrpC)Fig.1 Construction of secretory expression vector of Aspergillus niger pPHT-EGFP

1.2.4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定 將100 μL 上述轉(zhuǎn)化液涂布于再生培養(yǎng)基(再生培養(yǎng)基:麥芽糖5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉15 g，ddH2O 1 L，蔗糖0.8 mol/L，潮霉素0.1 g/L)，30℃培養(yǎng)3～4 d.將在抗性平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到PDA 抗性平板上(含有0.1 g/L 潮霉素)繼續(xù)培養(yǎng).提取單個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組，PCR 鑒定.將PCR 鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子孢子培養(yǎng)2 d(不加葡萄糖的PDA 培養(yǎng)基)，熒光顯微鏡紫外線下觀察菌絲形態(tài).

1.2.5 菌絲的培養(yǎng) 采用載片培養(yǎng)法(圖2):取圓形濾紙1 張，鋪放于1 個(gè)玻璃平皿底部，上面放一U形玻棒，其上再平放1 張干凈的載玻片與1 張蓋玻片，蓋好平皿蓋進(jìn)行滅菌.將1 cm2左右的較薄的原生質(zhì)體再生固體培養(yǎng)基放于載玻片中央，用接種環(huán)接種孢子，加上蓋玻片，并輕輕下壓.為防止培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基干燥，在培養(yǎng)皿中加入7～8 mL 滅菌的甘油(20 g 甘油溶于一定體積水中使總體積達(dá)到100 mL)，然后蓋上平皿蓋，30℃條件下培養(yǎng)，2 d 后在熒光顯微鏡下觀察.

圖2 真菌載片培養(yǎng)法Fig.2 Slide culture of fungi

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉基因組DNA 的提取

接種黑曲霉孢子于鋪有玻璃紙的PDA 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)18 h，孢子再次長(zhǎng)出之前，收集玻璃紙上的白色菌絲體，CTAB 法提取基因組DNA，基因組提取結(jié)果如圖3 所示，可以看到大于10 kb 的條帶.

圖3 黑曲霉基因組電泳檢測(cè)Fig.3 Electrophoresis analysis of Aspergillus nigerr genome

2.2 TtrpC、PglaA-g、PHT 和EGFP 基因的克隆

以質(zhì)粒sGFP 為模板，擴(kuò)增得到約800 bp 的TtrpC 基因，結(jié)果如圖4;以黑曲霉基因組DNA 為模板擴(kuò)增到約2 700 bp 的PglaA-g 基因，結(jié)果如圖5;以質(zhì)粒pEN51 為模板，PCR 擴(kuò)增得到約800 bp 的EGFP 基因，結(jié)果如圖6;以質(zhì)粒sGFP 為模板擴(kuò)增得到約4 000 bp的PHT 基因，PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖7.

圖4 TtrpC 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR result of TtrpC

圖5 PglaA-g 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR result of PglaA-g

圖6 EGFP 擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR result of EGFP

圖7 HygR 抗性篩選標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR result of HygR gene

對(duì)PglaA-g 基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Gene-Bank 登錄號(hào)為X00712 的糖化酶基因序列對(duì)比，Blast 分析顯示基因序列相似性為99%，圖8 所示為測(cè)序結(jié)果中部分糖化酶基因啟動(dòng)子、信號(hào)肽以及KEX2 多肽酶切割位點(diǎn)序列.

圖8 啟動(dòng)子、信號(hào)肽以及KEX2 多肽酶切割位點(diǎn)序列Fig.8 Sequences of promotor，signal peptide and KEX2

2.3 pPHT-EGFP 表達(dá)載體的雙酶切鑒定

通過(guò)雙酶切、連接的方法，依次將TtrpC、PglaAg、PHT、EGFP 與pUC19 質(zhì)粒連接，構(gòu)建pPHT-EGFP表達(dá)載體.將構(gòu)建好的表達(dá)載體用SpeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切結(jié)果如圖9 所示，切出約11 000 bp的pPHT 載體片段和約800 bp 大小的EGFP 基因片段，表明pPHT-EGFP 表達(dá)載體構(gòu)建成功.

2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR 鑒定

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后，按照CTAB 法提取轉(zhuǎn)化子的基因組，并以基因組為模板采用表1 中的檢測(cè)引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果如圖10 所示，挑取的4 株轉(zhuǎn)化子基因組PCR 均得到約1 700 bp 大小的條帶，表明4 株轉(zhuǎn)化子全部為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化入宿主菌.

圖9 pPHT-EGFP 質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.9 Identification of restriction enzyme digestion of pPHTEGFP

2.5 綠色熒光的觀察

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的孢子接種于PDA 固體培養(yǎng)基中(不加葡萄糖)，2 d 后于熒光顯微鏡下觀察菌絲形態(tài).

圖10 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果Fig.10 Identification of positive transformants

當(dāng)熒光顯微鏡激發(fā)出紫外光時(shí)，可以看到整個(gè)培養(yǎng)基都發(fā)出強(qiáng)烈的綠光，看不到菌絲，而培養(yǎng)基之外的區(qū)域可以清晰地觀察到單個(gè)菌絲的形態(tài)和熒光分布(圖11a)，只有綠色熒光蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基自身才可觀察到綠色熒光，所以本試驗(yàn)所構(gòu)建的載體屬于分泌性表達(dá)載體，由于糖化酶是黑曲霉自身的一種分泌性蛋白，所以糖化酶基因的信號(hào)肽序列(ss)有效地輔助了EGFP 的分泌過(guò)程;菌絲水平上，菌絲的橫膈處可以清晰地觀察到熒光聚集(圖11b)，菌絲胞質(zhì)中基本看不到亮光，菌絲頂端也可以看到明顯聚集的熒光(圖11c)，這些熒光聚集的部位暗示了蛋白的分泌部位，表明蛋白的分泌可能存在于菌絲的頂端和橫隔等處.

圖11 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子綠色熒光的觀察Fig.11 Observation of green fluorescence of positive transformants

3 討論與結(jié)論

黑曲霉是一種擁有巨大蛋白分泌潛力的微生物，長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是安全的工業(yè)生產(chǎn)菌株，而且與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，黑曲霉具有更高級(jí)的蛋白修飾和加工系統(tǒng).迄今為止已經(jīng)有大量蛋白在黑曲霉細(xì)胞工廠中成功表達(dá)，如全長(zhǎng)免疫球蛋白的成功表達(dá)，其在親和力、藥動(dòng)學(xué)等方面的特性與從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得的產(chǎn)物極為相似［18］;棘孢曲霉β-甘露聚糖酶在黑曲霉中的高效表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)到了自身產(chǎn)量的12 倍［19］;而IL-6 在黑曲霉蛋白缺陷菌株中的表達(dá)量可以達(dá)到150 mg/L［7］.由于黑曲霉廣闊的應(yīng)用前景，進(jìn)一步研究這一表達(dá)系統(tǒng)并且用于各種蛋白的表達(dá)，成為一個(gè)研究的新方向.

本試驗(yàn)采用融合表達(dá)策略［20］，成功構(gòu)建黑曲霉EGFP 表達(dá)載體，在啟動(dòng)子下游融合了部分糖化酶基因用于提高表達(dá)量，而且引入糖化酶基因自身的信號(hào)肽序列用于目的蛋白的分泌性表達(dá)［21-22］;同時(shí)，還引入黑曲霉KEX2 多肽酶切割位點(diǎn)用于融合蛋白與目的蛋白的分離［23］;通過(guò)在引物中加入限制性酶切位點(diǎn)，在載體中引入用于連接外源目的基因的多克隆位點(diǎn)(SpeⅠ-ApaⅠ-NotⅠ-XhoⅠ).與以往轉(zhuǎn)化試驗(yàn)效率較低不同，本試驗(yàn)成功摸索出高效的黑曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，所挑取的4 個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR 鑒定，全部為陽(yáng)性.菌絲頂端是絲狀真菌最主要的分泌部位，菌體中合成的大部分分泌性蛋白都要通過(guò)膈膜上的小孔運(yùn)輸?shù)骄z頂端，在這里實(shí)現(xiàn)胞外分泌［24］，本試驗(yàn)通過(guò)EGFP 的成功表達(dá)，清楚地觀察到黑曲霉的分泌特點(diǎn)，表達(dá)產(chǎn)物主要集中在培養(yǎng)基、菌絲頂端和菌絲膈膜等處.結(jié)果表明，在糖化酶信號(hào)肽和分泌性囊泡的輔助下，菌絲不同部位所表達(dá)的EGFP 通過(guò)膈膜向菌絲頂端聚集并完成分泌，在通過(guò)膈膜的過(guò)程中，一部分蛋白可能會(huì)滯留在膈膜上，形成膈膜上聚集的熒光.EGFP 的成功表達(dá)證實(shí)了該黑曲霉菌株作為外源蛋白生產(chǎn)宿主的可行性，為外源蛋白在黑曲霉中的表達(dá)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

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