馬 平 馬國榮 吳菊壽 齊 娟 杜送田

（蘭州生物制品研究所有限責任公司，甘肅 蘭州 730046）

凝膠法和動態(tài)濁度法在b型流感嗜血桿菌結合疫苗細菌內毒素控制中的應用比較

馬 平 馬國榮 吳菊壽 齊 娟 杜送田

（蘭州生物制品研究所有限責任公司，甘肅 蘭州 730046）

目的 在b型流感嗜血桿菌結合疫苗生產過程中采用凝膠法和動態(tài)濁度法檢測中間品、原液和成品中細菌內毒素含量，以此控制熱原，提高制品質量，并對兩種方法進行比較。方法 采用《中華人民共和國藥典》（2010年版）三部附錄Ⅻ E細菌內毒素檢查法中的凝膠法和動態(tài)濁度法。結果 Hib中間品、原液及成品經凝膠法和動態(tài)濁度法測定，內毒素含量均＜25EU/μg、5EU/μg、25EU/劑，符合規(guī)定。結論 各項檢定結果表明：應用動態(tài)濁度法和凝膠法檢測b型流感嗜血桿菌結合疫苗中間品、原液和成品細菌內毒素含量結果相符，動態(tài)濁度法定量檢測對于內毒素含量內控指標有很好的指導意義。

凝膠法；動態(tài)濁度法；b型流感嗜血桿菌結合疫苗

細菌內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁外層上的特有結構，內毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用于體溫調節(jié)中樞引起發(fā)熱,是制藥工業(yè)污染的主要因素，因此細菌內毒素檢查（BET）是藥品質量控制中的一項重要指標[1]。因此，生物制品必須經過細菌內毒素檢測試驗合格后才能使用。為保證b型流感嗜血桿菌結合疫苗質量，在生產過程和成品檢定中，使用凝膠法來判定產品內毒素檢測是否合格，用動態(tài)濁度法來定量細菌內毒素含量，以此來確定該制品細菌內毒素內控標準限值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：細菌內毒素工作標準品：中國食品藥品檢定研究院，批號：200965。凝膠法鱟試劑湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25EU/ mL，批號：120971。動態(tài)濁度法鱟試劑湛江安度斯生物有限公司，批號：1208102。細菌內毒素檢查用水湛江安度斯生物有限公司，批號：1304260。

1.1.2 設備：BET-32M，天津市天大天發(fā)科技有限公司；HH·W21-420BS數顯電熱恒溫水溫箱，上?？坪恪?/p>

1.1.3 供試品：精制b型流感嗜血桿菌結合疫苗莢膜多糖、b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結合疫苗成品，均有蘭州生物制品研究所有限責任公司菌苗三室生產。

1.2 方法

1.2.1 內毒素限值的確定：根據《中華人民共和國藥典》（2010年版）藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）按以下公式確定：L=K/ M，式中L為供試品的細菌內毒素限值，以EU/mL表示。K為人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K=5EU/（kg·h）。M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，以mL/（kg·h）表示。

1.2.2 確定最大有效稀釋倍數（MVD）：指在試驗中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數。用以下公式計算：MVD=cL/λ，式中L為供試品的細菌內毒素限值，c為供試品溶液的濃度。λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/mL）或在動態(tài)濁度法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。

1.2.3 凝膠法：鱟試劑靈敏度復核：取細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解后制成2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，取復溶后的0.1mL/支規(guī)格的鱟試劑10支，將其中8管排成4列，每列2管，分別加入2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內毒素標準溶液，另外2管加入0.1mL細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。觀察并記錄結果。干擾試驗用Hib精制多糖、原液、成品各3批進行。凝膠限度試驗：按表1制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數為MVD并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

表1 凝膠限度試驗

1.2.4 動態(tài)濁度法：標準曲線可靠性試驗：用細菌內毒素檢查用水溶解細菌內毒素工作標準品，混合30 min，然后逐級稀釋至內毒素為EU/mL的至少3個濃度的稀釋液，取以上標準品液各0.1mL分別加入預先加有0.1mL鱟試劑的反應管內，混合均勻，同時做2支陰性對照管。供試品動態(tài)濁度法定量測定：將Hib精多糖溶解為1μg/mL的溶液，原液稀釋至多糖含量為1μg/mL，成品直接測定。

2 結 果

2.1 內毒素限值的確定：根據《中華人民共和國藥典》（2010 年版）中有關b型流感嗜血桿菌結合疫苗細菌內毒素的規(guī)定，精多糖細菌內毒素應不高于25EU/μg，原液細菌內毒素應不高于5EU/μg，成品細菌內毒素每1次人用劑量應不高于25EU。

2.2 確定最大有效稀釋倍數（MVD）

2.3 鱟試劑靈敏度復核：陰性對照管結果為陰性，實驗有效。λc=0.25EU/mL，在0.5λ-2λ即0.125和0.5EU/mL之間，可用于細菌內毒素檢查，并以標識靈敏度λ=0.25EU/mL為該批鱟試劑的靈敏度。結果顯示該鱟試劑靈敏度符合要求。

2.4 干擾試驗：結果見表2。溶液A和陰性對照D的所有平行管都為陰性，并且C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內，結果顯示三批多糖、原液、成品中均無對試驗造成干擾的物質，試驗有效。

2.5 凝膠限度試驗：陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。

表2 干擾試驗（凝膠法）

2.6 動態(tài)濁度法標準曲線的可靠性試驗：標準曲線：lgT=2.9877+（-0.32011 lgC），|r|=0.9924＞0.9800。陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，變異系數CV%＜10%，試驗有效。

2.7 干擾試驗：部分結果見表3。λm=0.25EU/mL，供試品以3個稀釋度進行干擾試驗，變異系數均＜10%，回收率在50%～200%之間，符合藥典規(guī)定，在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。供試品在100倍稀釋情況下，回收率最接近100%，選擇此稀釋倍數為供試品檢查法時的稀釋倍數。

稀釋倍數 外加內毒素 EU/mL 反應時間 s 變異系數 cv 回收率rc（%）實測內毒素 EU/mL 原液含量 EU/mL

表3 干擾試驗（動態(tài)濁度法）

2.8 供試品內毒素含量定量檢測：標準曲線：lgT=2.97747+（-0.177667：lgC）相關系數：|r|=0.9985＞0.980，符合規(guī)定。Hib精多糖內毒素含量均＜25EU/μg，原液內毒素內毒素含量均小5EU/μg及成品內毒素均＜25EU/劑。結果見表4。

表4 b型流感嗜血桿菌結合疫苗細菌內毒素測定結果比較

3 討 論

細菌內毒素檢查法是用鱟試劑與細菌內毒素產生凝聚反應的機制，以判斷供試品中細菌內毒素是 否符合規(guī)定的一種方法。該法與熱原法比較具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、標準化實驗過程短，且可完成多批次供試品檢測等優(yōu)點[2]。供試品用兩種方法檢測，結果相符，均小于內毒素限值，細菌內毒素試驗凝膠定性法與動態(tài)濁度定量法，都是藥典規(guī)定的方法，凝膠定性法只能判定結果是否符合法規(guī)要求，而動態(tài)濁度定量法可以可以測出產品中細菌內毒素含量，以此作為參考，可以不斷提高產品細菌內毒素企業(yè)內控標準，保證產品質量。

[1] 王思理,胡冠時,貢立青.細菌內毒素檢查法及其應用[M].北京:氣象出版社,2002:38-81.

[2] 王璐,張紅宇,劉勤.凝膠法和光度法測定燈盞花素注射液中細菌內毒素的含量[J].昆明醫(yī)學院學報,2010,31(2):39-43.

Comparison of Gel-clot Test and Kinetic Turbidinetric Method Application in the Control of Bacterial Endotoxin in Hib

MA Ping, MA Guo-rong, WU Ju-shou, QI Juan, DU Song-tian
(Lanzhou Institute of Biological Products Co.Ltd, Lanzhou 730046, China)

Objective To detect the content of bacterial endotoxin in the intermediate, final bulk and finishied products of haemophilus type B conjugate vaccine with Kinetic turbidinetric method and gel clot test for the control of pyrogen and improving the quality of the products .Meanwhile compare with two methods. Method According to the Methods of Detection of Bacterial Endotoxin in the AppendixⅫE of The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China of the year 2010 edition.Results The detection limit for acterial endotoxin of the intermediate,final bulk and finishied products of Hib defined 25EU/μg、5 EU/μg、25 EU/dose,in accordance with the provisions. Conclusion The results of the tests indicate that application of kinetic turbidinetric method and gel clot test for detection of Haemophilus influenza type B conjugates vaccine intermediates,final bulk and finished products in accordance with the results of the content of bacterial endotoxin,quantitative Kinetic turbidinetric method is a good guidance for endotoxin content of internal control index.

Gel-clot test; Kinetic turbidinetric method; Haemophilus type B conjugate vaccine

R927

B

1671-8194（2013）34-0017-03