章 革，李 濤

（營口市婦產(chǎn)兒童醫(yī)院1.病理科；2.生殖科，遼寧 營口115000）

細胞粘附因子為一種細胞表面跨膜糖蛋白分子，分布于諸多細胞表面，包括淋巴細胞、單核細胞、RBC，成纖維細胞、上皮細胞、平滑肌細胞及腫瘤細胞等。CD44參與淋巴細胞的激活，以及細胞間透明質(zhì)酸的特異性粘附，變異性CD44基因的多樣性表達與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等腫瘤生物學行為相關(guān)。我們應(yīng)用免疫組化方法對乳腺癌中CD44S和CD44V6基因蛋白產(chǎn)物表達與組織學分型、脈管浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移、預后、復發(fā)等相關(guān)性進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集本院2000年1月—2010年12月間，161例原發(fā)性乳腺癌根治術(shù)后的臨床病理及隨訪資料，最大年齡83歲，最小年齡29歲，中位56歲。病史9個月—6年，最長隨訪時間為7年。根據(jù)WHO（2003）乳腺癌分類及分級標準，進行組織學分類，其中乳頭狀癌38例占23.6%，浸潤性導管癌62例占38.5%，硬癌38例占23.6%，導管原位癌4例占2.48%，小葉原位癌8例占4.96%，其它11例占6.83%。在161例乳腺癌研究樣本中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例11例占6.8%。所有標本均由10%福爾馬林固定，石蠟包埋，選自最具組織學分型代表性、最大腫瘤表面積，常規(guī)4－5μm連續(xù)切片，分別作HE染色及CD44s、CD44V6、CD34免疫組化染色。

1.2.1 主要試劑 鼠抗人CD44S單克隆抗體（DF1485）、CD44V6單克隆抗體（2F10）、CD34單克隆抗體（OBEnd／10）、SP免疫組化試劑盒均購自福州邁新公司。

1.2.2 方法 所有標本均常規(guī)切片，采用兩步法免疫組化染色；石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液中120℃抗原修復，PBS代替一抗作為陰性對照。脈管浸潤實驗研究采用CD34單抗標記脈管內(nèi)皮細胞，與H·E雙重染色鑒別血管、淋巴管。

1.3判斷標準CD44S200X全視野：（－）：陽性細胞數(shù)＜25%、（1＋）：陽性細胞數(shù)25%－50%、（2＋）：陽性細胞數(shù)50%－75%、（3＋）：陽性細胞數(shù)＞75%。CD44V6X200全視野：（－）：陽性細胞數(shù)＜25%、（1＋）：陽性細胞數(shù)25%－50%、（2＋）：陽性細胞數(shù)50%－75%、（3＋）：陽性細胞數(shù)＞75%。

脈管浸潤：以CD34陽性表達確認脈管內(nèi)皮細胞，管腔內(nèi)觀察到腫瘤細胞或瘤栓者為浸潤陽性。（管腔內(nèi)觀察到RBC為血管，無RBC是淋巴管）。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行處理，各組間相關(guān)性檢測采用Spearman等級相關(guān)分析檢驗。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中，CD44S陽性表達為32.9%，CD44V6陽性表達為67.1%，CD44陽性表達，在各組織學類型之間無顯著性差異（表1）。

表1 CD44基因蛋白表達與組織學分型（%）

2.2 脈管浸潤病例，在各組織學分型中，依次為硬癌＞浸潤性導管癌＞乳頭狀腺癌（表2）。

表2 脈管浸潤與組織學分型

2.3 脈管浸潤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、遠隔轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有顯著相關(guān)性（表3）。

表3 脈管浸潤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠隔轉(zhuǎn)移

2.4 腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶之間，CD44基因蛋白表達分別為：原發(fā)灶中，CD44S陽性表達73%，CD44V6陽性表達100%。腋窩淋巴結(jié)中，CD44S表達呈陰性，CD44V6陽性表達為64%（表4）。

2.5 應(yīng)用CD34基因蛋白標記脈管內(nèi)皮細胞，突出顯現(xiàn)脈管形態(tài)學特征并可直觀反映微血管生成狀態(tài)。

表4 腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶間CD44基因蛋白表達

3 討論

CD44是一種由單一基因編碼構(gòu)成的一類具有高度特異性的多功能單鏈跨膜糖蛋白，其變構(gòu)體CD44V6主要參與異質(zhì)性黏附，即瘤細胞與宿主細胞及宿主基質(zhì)的黏附，異質(zhì)性黏附在癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起到促進作用［1］。另有觀點認為：CD44V6可能通過改變癌細胞的骨架結(jié)構(gòu)和抗原位點的分布，獲得淋巴細胞樣免疫屏蔽，逃避機體免疫系統(tǒng)的識別，且更易于進入淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移瘤［2］。本實驗研究檢測161例乳腺癌標本中，CD44S陽性表達 為 32.9%，CD44V6 陽性 表 達為 67.1%，CD44V6的陽性表達明顯高于CD44S。說明CD44S的表達是一個較為復雜的生物學過程，即在同一腫瘤組織中，表現(xiàn)出粘附因子基本型的缺失而變異體CD44V6呈高表達。由此可推論CD44V6的高表達與乳腺癌組織生長及臨床進展密切相關(guān)。同時，本實驗研究中還顯示，CD44基因蛋白表達與乳腺癌各組織學分型之間相關(guān)性不明顯。

而伴隨乳腺癌病程的進展，在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，CD44S表達缺失，CD44V6呈現(xiàn)高表達（64%），即原發(fā)灶中CD44S表達73%，CD44V6表達100%。提示已有轉(zhuǎn)移的病例中，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中均能檢測出CD44V6的高表達；提示CD44V6陽性表達與乳腺癌進展、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的增強有關(guān)［1，3］。

另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)：CD44表達在腫瘤預后，復發(fā)統(tǒng)計中顯示：CD44V6的高性表達提示腫瘤預后不良，且證實與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能有相關(guān)性［4］。

血道和淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移形式，腫瘤血管是其供應(yīng)營養(yǎng)的物質(zhì)的主要途徑，淋巴管是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要途徑［5］。本研究應(yīng)用CD34標記脈管內(nèi)皮細胞，突出顯現(xiàn)脈管形態(tài)學特征，同時配合HE復染，準確地觀察到了脈管內(nèi)瘤細胞的浸潤及血管、淋巴管的鑒別。觀察結(jié)果顯示：CD34單克隆抗體 標記，內(nèi)皮細胞著色清晰，脈管形態(tài)顯現(xiàn)明了。脈管內(nèi)經(jīng)Eosin復染可確切觀察RBC的有無，以此鑒別血管或淋巴管。應(yīng)用該方法觀察發(fā)現(xiàn)：脈管浸潤與乳腺癌各組織學分型的生物學行為存在相關(guān)性，其發(fā)生率依次為硬癌＞浸潤性導管癌＞乳頭狀腺癌。脈管浸潤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）遠隔轉(zhuǎn)移（P＜0.005）有顯著相關(guān)性，提示CD44基因蛋白產(chǎn)物的表達，與有脈管浸潤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠隔轉(zhuǎn)移及脈管浸潤與組織學分型及生物學行為中有直接或間接意義。

綜上所述，細胞黏附因子CD44S、CD44V6在乳腺癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)等生物學過程中，發(fā)揮著生物介導、粘附作用。CD44S、CD44V6在癌組織中的強表達提示腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移、預后不良。腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶間CD44S表達缺失或減弱可能與CD44單抗的抑制、阻止及蛋白終產(chǎn)物生物學效應(yīng)的改變相關(guān)。CD44的變異性表達可作為早期診斷瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移、預后的生物學指標。CD34基因蛋白標記脈管內(nèi)皮細胞，突出顯現(xiàn)脈管形態(tài)學特征，可作為脈管內(nèi)瘤細胞觀察及血管、淋巴管鑒別的客觀指標和方法。

［1］Yoshida R，Kimura N，Harada Y，et al.Th loss of E－cadlherinalpha－and bcta－catenin expression is associated with metastsis and poor prognosis in inyasive breast canccr［J］.Int J Oneol，2001，18（3）：513.

［2］Afify A，Purnll P，Nguyen L.Role of CD44sand CD44V6on human breast cancer cell adhesion migration and invasion［J］.Exp Mol pathol，2009，86（2）：95.

［3］張 真，張小濤，于 蘭，等.乳腺癌CD44V6和Survivin的表達與臨床預后的相關(guān)性研究［J］.中國腫瘤臨床，2011，38（14）：835.

［4］Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44：from adhesion molecules to signaling regulators［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（1）：33.

［5］甄樂平，葉長生，劉民風，等.D2－40和CD34在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其意義［J］.南方醫(yī)科大學學報，2010，30（7）：1548.