朱 杰，趙成艷，王 敏，高艷飛，常青燕

（1.大連醫(yī)科大學第二臨床學院 檢驗科，遼寧 大連116027；2.遼河油田第二醫(yī)院 檢驗科，遼寧 盤錦124000；3.大連市第六人民醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連116021）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性惡性漿細胞（骨髓瘤細胞）在骨髓中異常增殖，并伴有單克隆免疫球蛋白（monoclonal immunoglobulin）增多為特征的疾?。?］，其發(fā)病機制尚不清楚。特點是單克隆的漿細胞在骨髓中異常增殖（可達骨髓內(nèi)細胞總數(shù)的90%），破壞骨髓造血功能并分泌單克隆免疫球蛋白或或其多肽鏈亞單位（如輕鏈，light chain，L），并通過多種機制產(chǎn)生臨床癥狀及體征。多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多種多樣，主要表現(xiàn)為骨髓瘤細胞增生、浸潤和破壞骨組織及髓外其他組織，出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、貧血、出血，以及骨髓瘤細胞產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白而出現(xiàn)感染、高鈣血癥、腎臟病變、高粘滯血癥、淀粉樣變等，尤其在疾病早期，表現(xiàn)無特異性，極易漏診和誤診，延誤治療、錯誤治療增加患者痛苦。國內(nèi)一般通過三色流式細胞術來對MM患者的骨髓細胞進行免疫表型特點的研究，而本實驗是通過四色流式細胞術對其進行免疫表型分析，以期望為MM的診斷提供高可靠的依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

樣本來源：2011年1月至2011年12月大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院住院MM患者45例，其中女性12例，男性33例，中位年齡60歲；均為初診患者，骨髓細胞學檢查瘤細胞占（15－95%），其中分泌型為37例（IgG型為27例，IgA型為10例）輕鏈型為5例（λ鏈型4例，κ鏈型1例），不分泌型3例。

1.2 儀器

流式細胞儀：FACSCalibur美國BD公司。

1.3 試劑

CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、 CD138－PE、CD45－APC、κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、κ－FITC／λ－PE、IgG2a－FITC、IgG1－PE，溶 血 素、破 膜劑，以上試劑均購自美國BD公司。

1.4 標本的采集

無菌操作抽取0.2ml骨髓液涂片作顯微鏡形態(tài)學檢查。另抽取2ml置于EDTA－K2抗凝血常規(guī)管作免疫分型，6h內(nèi)完成檢驗。

1.5 標本的處理

骨髓涂片行瑞氏－吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并分類計數(shù)200個有核細胞?？鼓墓撬枰簂 ml，加3 ml PBS液，混勻后，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，計數(shù)白細胞數(shù)，調(diào)節(jié)至5×106／ml，制成細胞懸液備用。

1.6 實驗方法

1.6.1 胞膜的標記及胞漿內(nèi)輕鏈的標記

（1）胞膜的標記：每管100μl細胞懸液分別加入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE、CD45－APC）、（CD38－FITC ／CD56－PE／CD19－Percp、 CD45－APC ）、（CD138－PE、CD45－APC）、（κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、CD45－APC）各20μl，混勻避光15min，加配置好的溶血素2ml，避光10min，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

（2）胞漿內(nèi)輕鏈的標記：取兩只試管，每管100 μl細胞懸液分別加入 CD45－APC 20μl，避光15 min，再加入破膜劑A液100μl，避光10min，加溶血素2ml，避光10min，在水平離心機上離心（1 500 r／min，5min），棄去上清液，加入溶血素B液50μl，分 別 加 入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE）、（κ－FITC／λ－PE），避光15min，加2ml PBS洗滌，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

1.6.2 流式細胞儀測定

用熒光微球校準儀器及補償后，用Cellquset軟件收取10000個細胞，通過CD45／SSC和CD38／CD56聯(lián)合設門，確定瘤細胞的位置及抗原表達情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個抗體陽性率＞20%為陽性，反之陰性。

2 結果

2.1 免疫表型的檢測結果

每例標本先在CD38／CD56圖中確定瘤細胞（CD38＋CD56＋或 CD38＋CD56－細胞群），然后在CD45／SSC圖中標記其瘤細胞位置，并根據(jù)此圈定瘤細胞群并設門，為以后的各圖分析做好準備，其瘤細胞比率占10.56%－75.45%，平均35.23%。見圖1和圖2、圖3和圖4。

圖1 中R1群為CD38＋CD56＋細胞群，在圖2中（CD45／SSC）表現(xiàn)為R3的位置為CD45－。圖3R1群為CD38＋CD56－細胞群，在CD45／SSC圖4中表現(xiàn)為R3的位置為CD45－。

2.2 多發(fā)性骨髓瘤瘤細胞免疫表型及胞漿輕鏈表達 見表1。

其中輕鏈型胞漿內(nèi)輕鏈的表達類型與血清蛋白電泳表達的完全一致。

表1 多發(fā)性骨髓瘤細胞免疫表型及胞漿輕鏈的表達

3 討論

關于瘤細胞的比率的問題，在骨髓片中的人工計數(shù)和流式細胞儀的計數(shù)中，由于留給做流式細胞術的骨髓液中常?；煅某潭却笥诠撬杓毎麑W的人工計數(shù)的骨髓片，而且程度不一，所以無法比較二者的關系。

臨床上，診斷多發(fā)性骨髓瘤（MM）一般根據(jù)骨髓細胞學和應用免疫學方法分析檢測血和尿的異常M蛋白及輕鏈。然而，有時形態(tài)學偏成熟的骨髓瘤細胞與正常的漿細胞在形態(tài)上難以區(qū)分。而采用免疫分型法對MM進行分析，是使之有效的方法。文獻 報 道［2，3］正 常 的 漿 細 胞 表 達 CD38＋、CD19＋、CD138＋、CD56－。我們對45例MM 患者的檢測結果表明：典型的骨髓瘤細胞免疫表型為CD45－／±、CD38＋、CD56＋／－、CD138＋、cκ＋／－或 cλ＋／－、CD56＋／－，而CD19－。

Van Camp等［4］報道多數(shù) （43／55，78%）MM患者有CD56＋表達，而正常漿細胞沒有CD56的表達。因此，有的人認為CD56是區(qū)分正常與惡性漿細胞的重要標志之一［5］。我們檢測的結果與Van Camp的相似，但CD56＋的細胞占（87%，39／45），比報道高。因此提示，雖然CD56是區(qū)分正常與惡性漿細胞的重要標志，CD56陽性有助于MM 的診斷，但CD56陰性不能除外MM的診斷，還應該結合其它特性進行綜合分析，這與黃春妮等人［6］的觀點一致。

CD19是包括正常漿細胞在內(nèi)的B細胞系的一個重要標志，但在我們檢測的45例MM標本中，無一例細胞具有 CD19＋表征，Adam［7］，Harada［8］，Ely SA［9］也表明CD19在MM中幾乎不表達。因此，應用多參數(shù)流式細胞術，根據(jù)特定細胞群CD56和CD19表型可以明確MM骨髓中瘤細胞的負荷量。本文中6例CD56MM中，3例為輕鏈型，3例為不分泌型，并且臨床表現(xiàn)較一致，均是外周血三系減少的病例，那么CD56－是否與疾病的不良過程有關，因本文的病例較少，需要長期的臨床觀察。

CD38：研究表明CD38是NAD糖基水解酶，與細胞增殖和激活有關。在人的正常骨髓中，無論是髓系或B淋巴系前體細胞以及成熟的淋巴細胞、單核細胞、粒細胞，CD38均有不同程度的表達，但僅在漿細胞表面可被檢測到超強表達，被認為是特異性的漿細胞表面標志［10］。CD38與多發(fā)性骨髓瘤的瘤細胞關系最為密切，常被用作骨髓瘤細胞的鑒定指標，一般認為，CD38在穩(wěn)定期仍高表達，表明穩(wěn)定期中雖然患者的臨床癥狀有所改善，骨髓中漿細胞比例恢復正常，但腫瘤克隆細胞仍沒有被完全清除［11］。

CD45：即白細胞分化抗原，是單鏈跨膜糖蛋白，屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員，它廣泛地存在于除了成熟紅細胞和血小板之外所有的造血系細胞表面，在淋巴細胞的發(fā)育激活中起重要作用。其廣泛表達于漿細胞表面，而在MM細胞中呈陰性或弱陽性表達。CD45是近期骨髓瘤免疫表型研究的一個新的熱點，CD45設門常被應用到MM的流式免疫分型中，但近年來發(fā)現(xiàn)［12］有相當比例的MM病人可監(jiān)測到CD45高強度表達，而幾乎所有的MM患者均含有一小群有增殖活性的漿細胞，此類細胞的表型特點為CD45強陽性，因此目前多結合CD138或CD38等其他表型抗原設門來提高流式免疫分型檢測的精確性。

CD138：Syndecan－1分子，屬于黏附分子跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員，其表達具有細胞類型和發(fā)育階段的特異性，它們可以參與細胞增殖、細胞黏附等多種功能，并與腫瘤細胞的歸巢及轉移等過程有關。CD138特異的表達于漿細胞，許多學者如河南鄭州的張琦［13］認為幾乎所有的MM患者均表達CD138，且不會在骨髓造血前體細胞和淋巴細胞上表達，因此，被認為是骨髓瘤細胞最特異的表面標志，丁潤生等人［14］曾報道多發(fā)性骨髓瘤的漿細胞主要表達CD138，并證明多發(fā)性骨髓瘤細胞CD138表達水平高于正常漿細胞，認為CD138陽性細胞即為骨髓瘤細胞。Garcia［15］，秦燕［10］等曾證實 MM 患者骨髓瘤細胞CD138陽性率幾乎達到100%。這些都證實了CD138為MM細胞最特異的表面標志。

本文中所有的 MM 中，全部表達CD138，但CD38、CD138表達并不特異，良性漿細胞亦有表達，故CD38、CD138可以作為骨髓瘤篩選和純化標志。由于CD138在骨髓瘤細胞的廣泛表達，是抗骨髓瘤靶向治療的理想的作用位點。可以認同以往的學者的觀點，即針對CD138抗原的單抗是一個有效的抗骨髓瘤的藥物。

檢測胞漿輕鏈判斷骨髓瘤細胞的克隆性具有高度的可靠性，張琦［13］認為一個B淋巴細胞克隆在其一生中僅僅產(chǎn)生兩型輕鏈中的一型，我們稱其為輕鏈的同型排斥，鑒于其克隆的獨特性，輕鏈的表達可以作為B系腫瘤的克隆增殖標志，因此如果所有B細胞的損害表現(xiàn)為輕鏈的單一表達，該腫瘤就很可能是單克隆的，相反的，如果兩種輕鏈數(shù)目接近于相等，則可能為多克隆的。胞漿輕鏈的檢測對于某些特殊類型的骨髓瘤的診斷是必須的，輕鏈型骨髓瘤細胞只分泌一種輕鏈，由于輕鏈的分子量很小，血清中檢測不到，因此胞漿輕鏈的檢測對確診起到不可忽視的作用，它也可用于意義未明的單株免疫球蛋白血癥，反應性漿細胞增多癥（monoelonal grammapathy of undetermined significance，MGUS）、重鏈病等的鑒別診斷。本文中3例骨髓細胞學找到典型的骨髓瘤細胞，但臨床檢查中免疫球蛋白及輕鏈檢測均是陰性，胞漿中輕鏈的檢測均陽性，給臨床確診和治療帶來了極大的便利。

本實驗利用BD公司最新的熒光免疫表型抗體及破膜劑進行胞膜抗原標記及胞漿內(nèi)染色，其陽性率令人滿意，所有的45例患者均檢測到相對應的胞漿輕鏈，而且與輕鏈檢測相對應（除不分泌型外）。為臨床的診斷提供了極大的幫助。

總之，利用四色流式細胞術進行CD45／SSC、CD38／CD56來標記骨髓瘤細胞，并進行 CD19、CD138、胞漿內(nèi)輕鏈的檢測，可準確地識別骨髓瘤細胞，有助于MM的診斷及治療療效的監(jiān)測。

［1］李金蘭，劉艷榮，常 艷，等.多發(fā)性骨髓瘤細胞的免疫表型特點［J］.中國實驗血液雜志，2002，10（3）：226.

［2］Ruiz－Arguelles GJ，San Miguel JF.Cell surface markers in multiple myeloma［J］.Mayo C1in Proc，1994，69（7）：684.

［3］Harada H，Kawano MM，Huang N，et al.Phenotypic difference of normal plasma cells from mature myeloma cells［J］.Blood，1993，81：2658.

［4］Van Camp B，Durie BG，Spier C，et al.Plasma cells in multiple myeloma express a natural killer－associated antigen：CD56（NKH－1；Leu－19）［J］.Blood，1990，76（2）：377.

［5］Gonzalez M，San Migue1JF，Gascon A，et al.Increase expression of natural－killer－associated and activation antigens in multiple myeloma［J］.Am J Hematol，1992，39：84.

［6］黃春妮，李 山，秦 雪.流式細胞術測定多發(fā)性骨髓瘤細胞表面標記的研究［J］.廣西醫(yī)學，2007，29（7）：953.

［7］Adam C.Immunophenotypic Differentiation Between Neoplastic Plasma Cells in Mature B－Cell Lymphoma vs Plasma Cell Myeloma［J］.Am J Clin Pathol，2007，127：176.

［8］Harada H，Kawano MM，Huang N，et al.Phenotypic difference of normal plasma cells from mature myeloma cells［J］.Blood，1993，81：2658.

［9］Ely SA，Knowles DM.Expression of CD56／neural cell adhesion molecule correlates with the presence of lyric bone lesions in multiple myeloma and distinguishes myeloma from monoclonal gammopathy of undetermined significance and lymphomas with plasmacytoid differentiation［J］.Am J Pathol，2002，160：1293.

［10］秦 燕，丁潤生，陸 偉.多參數(shù)流式細胞術在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的價值［J］.交通醫(yī)學，2009，23（2）：137.

［11］孫江飛，樓燕如，牧啟田，等.多發(fā)性骨髓瘤T細胞亞群及免疫表型分析［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學，2005，17（1）：17.

［12］李 倩，榮雯玉，劉尚勤.流式免疫分型在多發(fā)性骨髓瘤診治中的應用進展［J］.航空航天醫(yī)藥，2010，21（2）：265.

［13］張 琦.表面分化抗原及胞漿輕鏈堅持測在多發(fā)性骨髓瘤中的應用進展［J］.河南醫(yī)學研究，2006，15（1）：78.

［14］丁潤生，秦 燕，陸 偉，等.流式細胞術在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的應用［J］.中國實驗診斷學，2011，15（17）：1117.

［15］Garcia－Sanz R，Orfao A，Gonzalez M，et al.Primary plasma cell leukemia：clinical，immunophenotypic，DNA ploidy and cytogenetic characteristics［J］.Blood，1999，93：1032.