王 歡，張能英，孫興澤，周艷萌，吳中明

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系2009級(jí)，貴州遵義 563099;4.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2010級(jí)，貴州遵義 563099)

流感病毒(influenza virus)是引起急性呼吸道傳染病流感的病原體，尤其是甲型流感病毒，其傳染性強(qiáng)，且抗原性易頻繁變異造成大流行。近年來，在各國出現(xiàn)的豬流感、禽流感對(duì)人們的生命造成了極大威脅，所以流感的防治一直是世界各國共同關(guān)注的熱點(diǎn)。中醫(yī)中藥在抗病毒治療方面由來已久，有研究稱八角茴香是抗流感藥物達(dá)菲的原料來源，因此本研究采用MDCK細(xì)胞模型，擬檢測八角茴香的水提物及莽草酸是否有抑制流感病毒生長的作用，希望為流感的中草藥治療開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 狗腎傳代細(xì)胞MDCK，購于國家流感中心，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2 雞胚 購自遵義市某養(yǎng)雞場。

1.1.3 病毒 為H3N2型，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 藥物 八角茴香購于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，莽草酸購于浙江一新制藥股份有限公司(批號(hào):SA－060910)。

1.1.5 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone)，新生牛血清(四季青)，MTT(Amresco)。

1.2 方法

1.2.1 八角茴香水提物的制備 取干重20 g的八角茴香，加入適量的雙蒸水浸泡60 min，加熱煮沸30 min，收集濾液，再于藥渣中加入適量雙蒸水，加熱煮沸30 min，收集濾液，如此3次，將3次的濾液混合，濃縮至20 mL，先用普通濾紙過濾，再用0.22 μm一次性濾器過濾除菌，所得液體為藥物原液，濃度為1.0 g/mL，分裝，4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞消化后接種于96孔板中，細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/100 μL/孔;次日待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的藥物(八角茴香水提物及莽草酸)每組設(shè)6個(gè)平行孔，然后將板置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中液體，加入 DMSO，100 μL/孔，輕輕搖晃，使其結(jié)晶物充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測OD490的值，并按下述公式計(jì)算細(xì)胞存活率及抑制率。

1.2.3 病毒培養(yǎng)及TCID50的測定 將流感病毒接種于9日齡的雞胚尿囊腔，35℃孵育72 h，無菌操作收獲尿囊液。3 000 rpm離心15 min以除去沉淀。取少量進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，確定其效價(jià)大于1∶1 280后，將余下上清進(jìn)行分裝，置－80℃儲(chǔ)存。

取對(duì)數(shù)生長期的 MDCK細(xì)胞，按每孔5×103個(gè)加入96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，100 μL/孔，37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜。次日，將病毒用維持液做連續(xù)10 倍稀釋，共 8 個(gè)濃度(10－1、10－2、10－3、10－4…10－8)，加入至已貼壁的細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 d，逐日觀察記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。按Reed－Muench方法計(jì)算TCID50。

1.2.4 藥物對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的影響 在藥物的最大無毒范圍內(nèi)取3個(gè)濃度，按如下方式分別加入到細(xì)胞中:①藥物的預(yù)防作用組:在貼壁生長的細(xì)胞中加入不同濃度的藥液100 μL/孔，培養(yǎng)24 h后棄去孔中液體，再加入100 TCID50的病毒液，2 h后換為相應(yīng)濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng);②藥物的治療作用組:在貼壁生長的細(xì)胞中先加入 100 TCID50的病毒液，100 μL/孔，2 h 后棄去病毒液換為相應(yīng)濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)。以上各組均重復(fù)6孔，同時(shí)設(shè)有細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組以及陽性藥物(金剛烷胺)對(duì)照組，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，MTT法測定 OD490值，計(jì)算病毒抑制率(%)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，比較不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用以及對(duì)病毒的抑制作用。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) MTT結(jié)果顯示，在MDCK細(xì)胞上，隨著藥物濃度的增大，OD值越低，其中八角水提物的10 mg/mL組及莽草酸的0.1 mg/mL組對(duì)細(xì)胞無毒性作用，與相應(yīng)對(duì)照組比較無差異，故將此定為對(duì)MDCK細(xì)胞的最大無毒濃度(見圖1)。

2.2 病毒培養(yǎng)、擴(kuò)增及滴度測定 病毒經(jīng)在雞胚中擴(kuò)增后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按Reed－Muench法計(jì)算出 H3N2的 TCID50值為10－4/0.1 mL。

2.3 藥物對(duì)病毒感染細(xì)胞生長的影響 1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL濃度的八角水提物分別以不同方式作用于病毒感染的細(xì)胞，通過MTT法檢測細(xì)胞存活情況，結(jié)果表明:無論是預(yù)防用藥還是治療性用藥，細(xì)胞的存活率均高于病毒對(duì)照組(P＜0.01)，說明病毒生長受到抑制，且該作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，但是，效果均弱于陽性對(duì)照藥物金剛烷胺(見表1及圖2)，提示:在體外細(xì)胞模型中，八角水提物對(duì)流感病毒的感染有一定的預(yù)防和治療作用。同樣方法檢測莽草酸的作用，結(jié)果表明莽草酸不具有抑制流感病毒生長的作用。

圖1 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用

圖2 藥物對(duì)病毒感染細(xì)胞生長的影響

表1 八角水提物對(duì)甲型流感病毒H3N2增殖的影響(MTT法)(s)

表1 八角水提物對(duì)甲型流感病毒H3N2增殖的影響(MTT法)(s)

注:與病毒對(duì)照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 藥物濃度(mg/mL)OD值 病毒抑制率(%)

3 討論

八角茴香又名大茴香、八角、八月珠等，為木蘭科植物八角茴香(illicium verum hook.f.)的干燥成熟果實(shí)，性溫，味辛，有溫陽散寒和理氣止痛的功效，其主要含有揮發(fā)油和莽草酸［3－4］。揮發(fā)油中的茴香烯有抗真菌和細(xì)菌的作用［5－6］;而莽草酸在抗微生物方面的研究尚未見報(bào)道。但Bianco等在研究一種有抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶作用的化合物時(shí)所用到的基本物質(zhì)奎尼酸，最初就是由莽草酸改建而來［7］，也就是現(xiàn)在臨床用于抵抗禽流感的有效藥物——達(dá)菲(奧司他韋)，在其生產(chǎn)過程中就會(huì)用到莽草酸［8］。因此，本研究以八角茴香水提物及其主要成分莽草酸作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其抗甲型流感病毒的作用。

通過MTT法檢測八角茴香水提物及莽草酸對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示八角水提物與莽草酸的最大無毒濃度分別為10mg/mL和0.1mg/mL。抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:八角水提物對(duì)H3N2型流感病毒的感染有一定的預(yù)防和治療作用，且該作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，但是，效果弱于陽性對(duì)照藥物金剛烷胺;而其提取物——莽草酸未顯示有抗H3N2的作用。因此我們認(rèn)為:八角茴香作為一種藥物直接用于流感的防治，其效果并不樂觀。然而，在流感到來之際，于飲食當(dāng)中加入適量的八角茴香可以起到一定的預(yù)防治療作用。

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