杜子春 馬利 熊兵紅 程勇 張才全

胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。胃癌的病因尚未闡明，目前認(rèn)為致癌過程是多階段的，包括多個(gè)連續(xù)的“獨(dú)立”事件，即基因積累性改變的結(jié)果。多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)具有缺氧的微環(huán)境，腫瘤形成的關(guān)鍵步驟就是對(duì)缺氧的適應(yīng)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α)是細(xì)胞適應(yīng)缺氧而產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤組織中，HIF-1α均有過度表達(dá)并參與腫瘤血管形成［1，2］，包括腦、肺、膀胱、乳腺、結(jié)腸、卵巢、胰腺、腎和前列腺。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)為STAT轉(zhuǎn)錄因子家族成員中的重要一員。被認(rèn)為是一種癌基因，它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分，其持續(xù)激活導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［3-6］，本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌組織中HIF-1α和STAT3的表達(dá)，并研究?jī)烧咴谖赴┌l(fā)生中的相互作用，期望為胃癌的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院及外院2010年10月至2011年10月胃腺癌石蠟包埋標(biāo)本60(男46，女14)例，年齡26～74(平均55.6)歲。其中高分化17例，中分化27例，低分化16例，浸潤(rùn)程度:黏膜層14例，肌層20例，達(dá)漿膜層26例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，未轉(zhuǎn)移的32例，另取該組胃腺癌病例中腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本切緣處正常胃黏膜(病理證實(shí))石蠟包埋標(biāo)本15例及癌旁黏膜15例作為對(duì)照。胃癌的TNM分期按照AJCC 2003年版胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 染色方法 免疫組織化學(xué)染色:采用免疫組織化學(xué)SP法，已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作空白對(duì)照，一抗選用兔抗人HIF-1α多克隆抗體(1∶150)(稀釋度為1∶100)和STAT3兔抗人多克隆抗體(1∶100)。用SP法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒操作，操作步驟根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行，每組試驗(yàn)均以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判斷 HIF-1α，STAT 3陽(yáng)性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，采用二級(jí)計(jì)分法，即以染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞的百分比的乘積做為半定量標(biāo)準(zhǔn):染色強(qiáng)度:0分為無色;1分為黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色(深淺與背景色相對(duì)比)。陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比:陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分;10% ～50%為2分;51% ～75%為3分;＞75%為4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比的乘積0～3分為陰性(-);＞3分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性(+)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)資料性質(zhì)使用χ2檢驗(yàn)、Spearman檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和STAT 3在胃癌中的表達(dá) HIF-1α和STAT 3染色的陽(yáng)性細(xì)胞在組織中呈彌漫和(或)散在分布，HIF-1α著色部位主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。STAT 3定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(見圖1、圖2)。15例正常組織中HIF-1α和STAT 3均無表達(dá);HIF-1α和STAT 3在15例癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%(3/15)和26.67%(4/15);在60例胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為75%(45/60)和70%(42/60)。兩者在正常、癌旁、癌組織中的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，且癌組織與癌旁組織比較，癌組織與正常組織比較，其差異性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 HIF-1α和STAT 3表達(dá)陽(yáng)性與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HIF-1α和STAT 3的陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、性別、腫瘤的分化程度均無明顯關(guān)系(均P＞0.05)。HIF-1α和STAT 3的表達(dá)均與胃癌的浸潤(rùn)深度、臨床分期以及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在相關(guān)性(均P＜0.05，見表1)。

表1 胃癌臨床病理參數(shù)與HIF-1α和STAT 3陽(yáng)性表達(dá)間的關(guān)系(例，%)

圖1 HIF-1α在胃癌中的胞質(zhì)呈陽(yáng)性反應(yīng)(S-P法×200)

圖2 STAT3在胃癌中的胞質(zhì)胞核呈陽(yáng)性反應(yīng)(S-P法×200)

2.3 HIF-1α與STAT3蛋白表達(dá)的關(guān)系 60例胃癌中HIF-1α和STAT3蛋白共同表達(dá)陽(yáng)性者43例，共陰性者5例，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性而STAT3表達(dá)陰性者7例，HIF-1α表達(dá)陰性而STAT3表達(dá)陽(yáng)性者10例。二者表達(dá)呈正相關(guān)(Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)r=0.317，P＜0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中的STAT3和HIF-1α與表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

胃癌是一個(gè)多基因多階段的復(fù)雜病變過程。大量的證據(jù)證實(shí)致癌基因和抑癌基因的一系列遺傳學(xué)改變參入到其中，如致癌基因Ras的激活，以及抑癌基因APC、P53等的失活都已被證實(shí)參入了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。所以探討STAT3和HIF-1α在胃癌生物學(xué)行為中的病理價(jià)值，尋找胃癌生物治療的新途徑和預(yù)防治療胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新方法，成為提高胃癌患者生存率的關(guān)鍵和研究熱點(diǎn)。

HIF-1缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞中，由HIF-1α和H IF-1β構(gòu)成異二聚體，其中HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基。HIF-1α具有廣泛的靶基因譜，可啟動(dòng)多種基因的轉(zhuǎn)錄，在正常組織及良性病變中無表達(dá)，其功能涉及到腫瘤血管生成，細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控、糖代謝、離子代謝、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞凋亡和增殖、細(xì)胞黏附及炎性反應(yīng)等多個(gè)方面。HIF-1α在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，它不僅調(diào)節(jié)血管形成，調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而且它可以反饋接受腫瘤生長(zhǎng)過程中所產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達(dá)，如此形成惡性循環(huán)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)特性。胃癌組織中HIF-1α表達(dá)增高可以作為胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要判定指標(biāo)，可能為胃癌的早期診斷及臨床判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。本結(jié)果顯示，HIF-1α癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁和正常組織，其表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有相關(guān)性，這也說明HIF-1α高表達(dá)的腫瘤組織具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力。

STAT3是一關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白，研究已證實(shí)STAT3的持續(xù)激活、表達(dá)水平升高與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)［7，8］，STAT3的表達(dá)可以調(diào)控該轉(zhuǎn)錄因子參與的多種異常的腫瘤信號(hào)途徑:如抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2的表達(dá)，細(xì)胞周期控制基因C-fos、C-Myc、cyclin D1的表達(dá)等，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞凋亡［7，8］。因此STAT3基因被公認(rèn)為是重要的癌基因之一。研究發(fā)現(xiàn)STAT3與胃癌的發(fā)病關(guān)系密切，Gong等［4］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中STAT3的表達(dá)與VEGF、MVD(微血管密度)有關(guān)，可能通過活化VEGF的表達(dá)增加了胃癌的血管表現(xiàn)型，促進(jìn)了胃癌的發(fā)展與進(jìn)展。Kanda等［9］發(fā)現(xiàn)STAT3組成性活化于多種胃癌細(xì)胞系中，利用異位顯性負(fù)相STAT3及酪氨酸磷酸化抑制劑AG490抑抑制STAT3的表達(dá)可以誘導(dǎo)凋亡。多項(xiàng)研究已證實(shí)，STAT3在胃癌組織中過度表達(dá)。我們的結(jié)果也表明了胃癌組織中存在著STAT3的高表達(dá)，并且與胃癌的TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分級(jí)密切相關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。因此STAT3的異?；罨c胃癌的惡性生物學(xué)行為以及胃癌的發(fā)病機(jī)制有著極其密切的關(guān)系。

在多種癌癥中STAT3活性表達(dá)和HIF-1都在上游被調(diào)控。有研究證明，需要Stat3才能誘導(dǎo)基礎(chǔ)和生長(zhǎng)信號(hào)導(dǎo)致的HIF-1表達(dá)。此外，由多個(gè)腫瘤生長(zhǎng)刺激因(IL-6R，C-Src，Her2/Neu)誘導(dǎo)的 VEGF在沒有 STAT3信號(hào)時(shí)會(huì)減少［10］。Xu等［11］進(jìn)一步闡明了STAT3能夠調(diào)節(jié)Akt的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的HIF-1的高表達(dá)，他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中，以小分子抑制劑作用于STAT3實(shí)現(xiàn)了阻斷HIF-1和VEGF表達(dá)，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示，當(dāng)STAT3被抑制后，由IL-6R和Jak/Stat，PI3K/Akt等信號(hào)通路誘導(dǎo)激活的血管生成能力也被抑制，從而抑制了腫瘤生長(zhǎng)和血管生成。因此，STAT3可能對(duì)HIF-1和VEGF的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，對(duì)于腫瘤的靶向治療具有更大意義。我們研究顯示STAT3與HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，表明STAT3可能調(diào)節(jié)胃癌組織中HIF-1α、VEGF的表達(dá)，參與其侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，STAT3與HIF-1α在胃癌組織中過度表達(dá)，共同提示著它們與胃癌的關(guān)系非常密切。STAT3與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者可能在胃癌的發(fā)生及發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起著重要協(xié)同作用，臨床上檢測(cè)二者的表達(dá)有助于胃癌治療及判斷預(yù)后，但是其具體分子生物學(xué)作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究闡明。

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