高 銳 苑春莉 孫連坤 王 玲 康勁松

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

中國(guó)林蛙(Rana temporaria chensinensis David)是兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科、蛙屬動(dòng)物，其干燥輸卵管稱為林蛙油，是一種名貴食療性中藥。近年來(lái)的研究顯示由提取林蛙油剩余的卵以及由卵提取的林蛙卵精油的保健價(jià)值更高〔1，2〕。本研究旨在分析林蛙卵油對(duì)于大鼠卵巢凋亡指數(shù)和Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，分析林蛙卵油對(duì)卵巢細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 雄激素處理模型制作及分組 選擇9日齡Wistar清潔雌性大鼠50只，其中模型組40只，丙酸睪丸酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射，建立丙酸睪丸酮誘導(dǎo)的卵巢損傷大鼠模型;正常對(duì)照組10只，同期生理鹽水皮下注射〔3，4〕。分為高劑量(1.0 g/d)組、中劑量(0.4 g/d)組、低劑量(0.1 g/d)組，模型組和正常對(duì)照組，每組10只，各組在造模成功后喂養(yǎng)110 d至成年。模型組和正常對(duì)照組用生理鹽水3 ml/d灌胃;林蛙卵油各劑量組應(yīng)用林蛙卵油灌胃，用生理鹽水稀釋至3 ml，灌胃15 d后處死大鼠。采出右側(cè)卵巢放入甲醛溶液固定，左側(cè)卵巢立即放入 －70℃冰箱中速凍〔3，4〕。

1.2 Tunnel檢測(cè) Tunnel試劑盒購(gòu)自Sigma公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自Sigma公司。用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(S-P法)染色。

1.3 Western印跡法檢測(cè) 按照常規(guī)方法進(jìn)行，蛋白提取、配制分離膠和濃縮膠、加樣、電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗、加入二抗、顯色、記錄。

1.4 結(jié)果制定 Tunnel染色陽(yáng)性為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。凋亡指數(shù)(AI)計(jì)算方法:隨機(jī)選擇10個(gè)凋亡腫瘤細(xì)胞數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比(細(xì)胞凋亡%=凋亡的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) ×100%)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Tunnel免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 模型組的凋亡指數(shù)(43% ±1.97%)較正常對(duì)照組(22% ±0.92%)升高，給予林蛙卵油后，凋亡指數(shù)降低。正常對(duì)照組與模型組有顯著差異(P＜0.05)，中劑量組(30% ±0.74%)和高劑量組(31% ±0.96%)與模型組有顯著差異(P＜0.05)，低劑量組(39% ±1.12%)與模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 Western印跡結(jié)果 隨著藥物劑量增加，Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增加。與模型組比較，中劑量組和高劑量組的灰度值變化有顯著差異(P＜0.05)。見圖1和表1。

表1 各組大鼠Bcl-2、Bax的灰度值比(n=10)

3 討論

林蛙卵中含有多種微量元素、維生素、不飽和脂肪酸、磷脂、氨基酸，富含雌二醇、孕酮〔1，2〕。林蛙卵油具有溫和的降低血脂，軟化血管，抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué)特征、抑制血脂沉積作用〔5〕;有一定的中樞抑制作用〔6〕，有明顯的增強(qiáng)機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，調(diào)節(jié)免疫的抗衰老的生物作用〔7〕，而且沒(méi)有明顯毒副反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種具有形態(tài)學(xué)變化而不同于細(xì)胞壞死的死亡方法，凋亡在卵巢退化中發(fā)揮作用，存活前和凋亡前因子在卵巢凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用，其間的精細(xì)調(diào)節(jié)對(duì)于卵巢的最終命運(yùn)發(fā)揮了決定性作用:卵泡閉鎖過(guò)程主要有Bcl-2家族成員、腫瘤壞死因子(TNF)和Caspases參與;排卵有Bcl-2，Bax，卵泡刺激素(FSH)，抑制素(inhibin)，F(xiàn)as配體，caspases等參與〔8〕。我們制造的雄激素大鼠模型在形態(tài)學(xué)和部分內(nèi)分泌學(xué)特性上符合多囊卵巢綜合征的特點(diǎn)，其形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為卵泡閉鎖和持續(xù)不排卵〔3，4〕。本文結(jié)果說(shuō)明雄激素可以促進(jìn)卵巢凋亡，給予林蛙卵油灌胃后降低卵巢細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，起到保護(hù)卵巢的作用。該保護(hù)作用有一定的劑量依賴性，需要林蛙卵油濃度達(dá)到一定程度。

B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白質(zhì)家族包括存活前因子(Bcl-2，Mcl-1和Bcl-XL等)和凋亡前因子(Bax，Bcl-2相關(guān)X蛋白等)。Bcl-2是一種存活前因子，它定位于核膜和線粒體，它通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體釋放細(xì)胞色素C和Apaf-1和caspases-9的相互作用，與Bax結(jié)合，阻止由c-Myc引起的凋亡發(fā)揮抑制凋亡功能。Bax是凋亡前因子，定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，對(duì)抗Bcl-2的防護(hù)作用。Bcl-2主要在發(fā)育卵泡中表達(dá)，Bax主要在閉鎖卵泡中表達(dá)〔9，10〕。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)給予雄激素均使得卵巢前存活因子Bcl-2表達(dá)降低，而前凋亡因子Bax表達(dá)增加，提示雄激素增強(qiáng)了卵巢細(xì)胞的凋亡。給予林蛙卵油灌胃后，前存活因子Bcl-2表達(dá)有升高趨勢(shì)，而前凋亡因子Bax表達(dá)有降低趨勢(shì)，差異均有顯著性，提示林蛙卵油可以通過(guò)影響B(tài)cl-2蛋白質(zhì)家族抑制卵巢細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮保護(hù)卵巢的作用。

1 苑春莉，孫連坤，康勁松.林蛙卵油灌胃對(duì)于雄激素預(yù)處理大鼠婦科內(nèi)分泌的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010;14(2):196-8.

2 苑春莉，盛 輝，孫連坤，等.林蛙卵油灌胃對(duì)于雄激素預(yù)處理大鼠卵巢凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(17):2451-2.

3 王 宇，尚德靜，馮伯森.中國(guó)林蛙蛙卵營(yíng)養(yǎng)成分分析〔J〕.遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004;27(4):471-3.

4 杜景新，王 麗，李春慧，等.林蛙油、林蛙卵油的成分及開發(fā)利用〔J〕.人參研究，2003;3(5):18-9.

5 彭 飛，徐 峰，劉 彬，等 中國(guó)林蛙卵油對(duì)高脂血癥大鼠降脂作用的觀察，醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2003;16(9):996-7.

6 彭 飛，韋媛媛，佟 巖，等.中國(guó)林蛙卵油抗的士寧驚厥的機(jī)制〔J〕.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005;22(5):386-9.

7 彭 飛，徐 峰，趙 倩，等.中國(guó)林蛙卵油的抗驚厥作用及其與單胺神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系〔J〕.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005;40(12):912-5.

8 Matsuda F，Inoue N，Manabe N，et al.Follicular growth and atresia in mammalian ovaries:regulation by survival and death of granulosa cells〔J〕.JReprod Dev，2012;58(1):44-50.

9 Abir R，Orvieto R，Dicker D，et al.Preliminary studies on apoptosis in human fetal ovaries〔J〕.Fertil Steril，2002;(78):259-64.

10 Hsu SY，Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm〔J〕.Physiol Rev，2000;80(2):593-614.