姜 謐 劉 敏 尚 健 曹鵬宇

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管疾病診療中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

一氧化氮(NO)是一種重要的血管擴(kuò)張因子，由三種類(lèi)型的NO合成酶(NOS)合成而來(lái):內(nèi)皮型NOS(eNOS)，神經(jīng)型NOS(nNOS)和誘導(dǎo)型 NOS(iNOS)〔1〕。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)體內(nèi)血管和腎臟的eNOS和nNOS的表達(dá)明顯高于正常血壓大鼠(WKY)〔2〕。SHR體內(nèi)NOS的活性和NO的產(chǎn)量顯著升高〔3〕，而且NOS阻斷劑可以明顯升高SHR的血壓〔4〕。可見(jiàn)，SHR體內(nèi)由NO介導(dǎo)的血管擴(kuò)張應(yīng)答被顯著削弱〔5〕。氧化壓力(OS)與多種病理生理狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。本文通過(guò)探討OS在腎臟NOS表達(dá)調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用，旨在分析apocynin與tempol對(duì)SHR和WKY腎臟NOS表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分組 5周齡的SHR和WKY大鼠，隨機(jī)分成三組:對(duì)照組、apocynin、tempol組，每組10只，皆喂食標(biāo)準(zhǔn)食，但飲水分別為:普通水，apocynin投藥水(2 mmol/L)，tempol投藥水(2 mmol/L)。共計(jì)8 w，動(dòng)物飼養(yǎng)和試驗(yàn)條件都符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 血壓與血漿、尿液標(biāo)本的采集 試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束分別用尾靜脈tail-cuff法測(cè)定大鼠的收縮壓(SBP)，機(jī)器型號(hào):Model UR-5000Ueda，Tokyo，Japan。試驗(yàn)結(jié)束的前1 d，大鼠分別進(jìn)行24 h的代謝籠試驗(yàn)，以獲取24 h的尿量和尿液標(biāo)本。試驗(yàn)最后1 d，斷頭取血，離心機(jī)1 500 r/min，5 min，取上清液血漿于－80℃冰箱保存。

1.2.2 血漿及尿液標(biāo)本的生化指標(biāo)測(cè)定 肌酐(Scr)，尿素氮指標(biāo)(BUN)，過(guò)氧化氫(H2O2)含量應(yīng)用試劑盒 Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)進(jìn)行測(cè)定〔6〕。NO 體內(nèi)代謝總產(chǎn)物(NOx)通過(guò)格里斯試劑法，應(yīng)用試劑盒Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay kit(Cayman Chemical Company，Anna Arbor，Michigan，USA)進(jìn)行測(cè)定〔7〕。

1.2.3 組織分離與免疫測(cè)定 斷頭取血后，腎臟和大動(dòng)脈迅速的被摘取剝離，然后腎臟進(jìn)一步分離為皮質(zhì)、髓質(zhì)外層和髓質(zhì)內(nèi)層三部分。制作組織勻漿，高速離心機(jī)分離，取上清液于－80℃冰箱保存。組織樣本的蛋白含量測(cè)定參照 Bradford method〔8〕。NADPH氧化酶活性作為O2-生成量的指標(biāo)，通過(guò)光澤精化學(xué)光反應(yīng)法進(jìn)行測(cè)定〔9〕。腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)外層、髓質(zhì)內(nèi)層及大動(dòng)脈的eNOS和nNOS的蛋白表達(dá)量，通過(guò)Western印跡免疫印跡法進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照組蛋白表達(dá)量設(shè)為1，其他組別的濃度與之比較，應(yīng)用Image J軟件算出。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表達(dá)形式為數(shù)據(jù)分析應(yīng)用方差分析法，多組之間采用多因素分析的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓、生化指標(biāo)比較 SHR對(duì)照組的收縮壓(SBP)，血漿及尿液的H2O2和NOx含量都明顯高于WKY對(duì)照組(P＜0.01);但兩組間的Scr和BUN含量，以及肌酐清除率沒(méi)有明顯的差異。SHR，apocynin和tempol都明顯降低SBP;其中，tempol投藥組比SHR對(duì)照組的Scr明顯減少，肌酐清除率明顯增加，而apocynin投藥組和SHR對(duì)照組相比則沒(méi)有變化;apocynin顯著降低血漿及尿液H2O2和NOx的含量，而tempol則與其相反，顯著增加其含量。WKY大鼠中，無(wú)論apocynin還是tempol對(duì)SBP及血漿尿液的生化指標(biāo)都沒(méi)有顯著影響。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠腎組織NADPH氧反酶活性比較 SHR對(duì)照組較WKY對(duì)照組腎臟皮質(zhì)及髓質(zhì)外層的NADPH氧化酶活性水平都有顯著增加〔皮質(zhì):(27 743±507)vs(6 720±339)counts/min per mg protein，髓質(zhì)外層:(21 038±513)vs(6 326±343)counts/min per mg protein(P＜0.01)〕。隨之內(nèi)層的NADPH氧化酶活性沒(méi)有被測(cè)出。SHR中，apocynin和tempol都分別顯著降低了腎臟皮質(zhì)(72%和56%)及外髓質(zhì)(71%和55%)NADPH氧化酶活性水平;WKY大鼠中，只有apocynin顯著降低了腎臟皮質(zhì)(48%)及外髓質(zhì)(43%)水平。

2.3 各組大鼠腎組織eNOS、nNOS、硝基酪氨酸水平比較SHR對(duì)照組和WKY對(duì)照組比較，無(wú)論是eNOS，nNOS還是硝基酪氨酸，其在腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)外層、髓質(zhì)內(nèi)層、大動(dòng)脈的表達(dá)都顯著升高。把WKY作為對(duì)照組，免疫印跡濃度設(shè)定為1.0，SHR腎組織各層eNOS水平:腎臟皮質(zhì):1.59±0.046，髓質(zhì)外層:1.39±0.038，髓質(zhì)內(nèi)層:1.42±0.043，大動(dòng)脈:1.35±0.032;nNOS水平:腎臟皮質(zhì):1.41±0.026，髓質(zhì)外層:1.37±0.028，髓質(zhì)內(nèi)層:1.44±0.031，大動(dòng)脈:1.31±0.026;硝基酪氨酸水平:腎臟皮質(zhì):1.56±0.037，髓質(zhì)外層:1.58±0.045，髓質(zhì)內(nèi)層:1.64±0.042，大動(dòng)脈:1.55±0.033。apocynin顯著降低SHR的eNOS和nNOS表達(dá)(以對(duì)照組的免疫印跡濃度設(shè)定為1.0，eNOS水平:腎臟皮質(zhì):0.62±0.028，髓質(zhì)外層:0.71±0.032，髓質(zhì)內(nèi)層:0.75±0.038，大動(dòng)脈:0.69±0.031;nNOS水平:腎臟皮質(zhì):0.61±0.029，髓質(zhì)外層:0.76±0.033，髓質(zhì)內(nèi)層:0.78±0.027，大動(dòng)脈:0.71±0.029)。而tempol則與之相反，顯著提高其表達(dá)(以對(duì)照組的免疫印跡濃度設(shè)定為1.0，eNOS水平:腎臟皮質(zhì):1.55±0.042，髓質(zhì)外層:1.57±0.048，髓質(zhì)內(nèi)層:1.71±0.047，大動(dòng)脈:1.59±0.047;nNOS水平:腎臟皮質(zhì):1.58±0.045，髓質(zhì)外層:1.43±0.041，髓質(zhì)內(nèi)層:1.64±0.045，大動(dòng)脈:1.42±0.046)。而對(duì)于WKY大鼠，apocynin和tempol都沒(méi)有明顯作用。SHR中，apocynin和tempol都顯著降低腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)外層、髓質(zhì)內(nèi)層、大動(dòng)脈硝基酪氨酸的表達(dá)(以對(duì)照組的免疫印跡濃度設(shè)定為1.0，apocynin組腎臟皮質(zhì):0.49±0.026，髓質(zhì)外層:0.52±0.039，髓質(zhì)內(nèi)層:0.48±0.037，大動(dòng)脈:0.47±0.028，tempol組腎臟皮質(zhì):0.52±0.033，髓質(zhì)外層:0.53±0.042，髓質(zhì)內(nèi)層:0.51±0.039，大動(dòng)脈:0.49±0.035)。而在WKY大鼠中，僅apocynin顯著降低其表達(dá)(以對(duì)照組的免疫印跡濃度設(shè)定為1.0，apocynin組腎臟皮質(zhì):0.64±0.041，髓質(zhì)外層:0.71±0.041，髓質(zhì)內(nèi)層:0.67±0.036，大動(dòng)脈:0.72±0.034;tempol組無(wú)變化)。

表1 apocynin和tempol對(duì)SHR和WKY大鼠血壓及生化指標(biāo)的影響，n=6)

表1 apocynin和tempol對(duì)SHR和WKY大鼠血壓及生化指標(biāo)的影響，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

?

3 討論

結(jié)果顯示:雖然apocynin和tempol對(duì)于SHR，都有降低血壓、抑制腎臟NADPH氧化酶活性和減少腎臟硝基酪氨酸表達(dá)的作用，但二者在H2O2和NO終產(chǎn)物以及腎臟NOS表達(dá)水平上的作用效果卻是相反的。相比于SHR，無(wú)論是apocynin還是tempol對(duì)WKY基本沒(méi)有明顯的作用。

NADPH氧化酶是高血壓發(fā)病進(jìn)程中最主要的超氧負(fù)離子O2-的來(lái)源〔10〕。O2-和NO反應(yīng)生成 ONOO-，一方面導(dǎo)致 NO 活性的失活和其進(jìn)一步擴(kuò)血管作用的減弱;另一方面，ONOO-與酪氨酸結(jié)合生成誘導(dǎo)組織損傷的硝基酪氨酸〔11〕。所以，硝基酪氨酸水平被用來(lái)作為ONOO-生成量的指標(biāo)。本研究結(jié)果中，SHR升高的腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)NADPH氧化酶活性，血漿和尿H2O2含量，以及腎臟和大動(dòng)脈硝基酪氨酸水平等都與以往先前的研究結(jié)果相一致〔3〕。此外，先前的研究也有報(bào)道，SHR腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)的過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽的含量，并沒(méi)有明顯高于 WKY〔3，10〕。由此可見(jiàn)，SHR體內(nèi)升高的腎臟 ROS水平，可能主要來(lái)源于NADPH氧化酶產(chǎn)生的超氧陰離子。

有研究也表明，長(zhǎng)期的apocynin治療，具有降低SHR血壓和抑制NADPH氧化酶活性水平的功效〔3，12〕;急性或長(zhǎng)期tempol治療可以通過(guò)將O2-代謝成水的作用，起到對(duì)SHR降壓和降低NADPH氧化酶活性的作用〔13〕。本研究更發(fā)現(xiàn)升高的SHR腎臟和大動(dòng)脈的硝基酪氨酸水平，通過(guò)apocynin或tempol治療而得以改善?？梢?jiàn)apocynin和tempol的抗高血壓作用，主要通過(guò)降低超氧陰離子的產(chǎn)生和改善超氧陰離子誘導(dǎo)的NO失活而實(shí)現(xiàn)。盡管apocynin和tempol在SHR的NOS表達(dá)和NO生成量，以及血漿和尿的過(guò)氧化氫含量的作用上正好相反，但無(wú)論是apocynin還是tempol并不影響WKY體內(nèi)過(guò)氧化氫和NOx含量以及NOS表達(dá)水平。因此，apocynin和tempol影響NOS表達(dá)和NO生成量，具有對(duì)體內(nèi)高氧化應(yīng)激狀態(tài)的SHR選擇特異性。

目前為止，本文是第一個(gè)對(duì)比apocynin和tempol對(duì)SHR大鼠腎臟NOS表達(dá)效果的研究。雖然先前有抗氧化劑lazanoid緩解SHR體內(nèi)組織上調(diào)的NOS表達(dá)的報(bào)道〔14〕，但本文的結(jié)果中:apocynin降低SHR腎臟各部分NO的生成量和NOS表達(dá)水平卻和以往其他的apocynin研究不盡相同。以往，有研究顯示，4 w的apocynin治療可以增加SHR大動(dòng)脈NOS的活性〔15〕，3 w的apocynin治療可以恢復(fù)SHR近腎小球升高的nNOS表達(dá)〔16〕，1 w可以減少SHR腸系膜動(dòng)脈外周血管的NO濃度〔5〕。但也有研究表明6 w的apocynin治療沒(méi)有任何效果〔5〕。本研究中，長(zhǎng)期的tempol治療對(duì)SHR腎臟各部分組織NOS表達(dá)的效果，還是首次被報(bào)道。

關(guān)于高血壓狀態(tài)下，上調(diào)的NOS表達(dá)水平的機(jī)制假說(shuō)有許多種。既包括機(jī)械壓機(jī)學(xué)說(shuō)〔17〕，NO失活理論〔18〕，氧化應(yīng)激理論〔4〕，也包括過(guò)氧化氫誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)〔18〕。本研究結(jié)果中，雖然apocynin和tempol都降低SHR的血壓，抑制腎臟NADPH氧化酶活性和減少硝基酪氨酸水平;但apocynin減少而tempol增加腎臟NOS的表達(dá)和NO的生成量。這一對(duì)立的效果，無(wú)法簡(jiǎn)單的用機(jī)械壓力學(xué)說(shuō)(血壓)，NO失活理論(ONOO-)，以及腎臟NADPH氧化酶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激理論來(lái)解釋。而本研究這一對(duì)立的作用效果，卻和血漿及尿液H2O2的變化相匹配。因此揭示H2O2可能作為中介介質(zhì)，上調(diào)SHR腎臟NOS的表達(dá)。此外，以往的研究報(bào)道，2 w的tempol治療可以增加SHR 17%的腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)。Tempol增加SHR的GFR，改善腎髓質(zhì)血流等作用，可能是通過(guò)改善NO生物活性而實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)?，tempol增加了SHR腎臟過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的NOS表達(dá)，同時(shí)減少了超氧陰離子誘導(dǎo)的NO失活。

總之，本研究揭示活性氧簇中的內(nèi)源性過(guò)氧化氫，可能是一種中間媒介，通過(guò)其可以誘導(dǎo)SHR腎臟NOS的表達(dá)和NO的生成。因此，SOD類(lèi)抗氧化劑的治療不僅有降壓作用，還有高血壓狀態(tài)下的腎臟保護(hù)作用。這些作用主要依賴(lài)于心血管系統(tǒng)和腎臟NO生物活性的改善。

1 Moncada S，Higgs A，F(xiàn)urchgott R.International Union of Pharmacology Nomenclature in Nitric Oxide Research〔J〕.Pharmacol Rev，1997;49(2):137-42.

2 Vaziri ND，Ni Z，Oveisi F，et al.Effect of antioxidant therapy on blood pressure and NO synthase expression in hypertensive rats〔J〕.Hypertension，2000;36(6):957-64.

3 Zhou X，Bohlen HG，Miller SJ，et al.NAD(P)H oxidase-derived peroxide mediates elevated basal and impaired flow-induced NOproduction in SHR mesenteric arteries in vivo〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008;295(3):H1008-16.

4 Verhagen AMG，Koomans HA，Joles JA.Predisposition of spontaneously hypertensive rats to develop renal injury during nitric oxide synthase inhibition〔J〕.Eur J Pharmacol，2001;411(1-2):175-80.

5 Sunano S，Li-Bo Z，Matsuda K，et al.Endothelium-dependent relaxation by alpha 2-adrenoceptor agonists in spontaneously hypertensive rat aorta〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，1996;27(5):733-9.

6 Sousa T，Pinho D，Morato M，et al.Role of superoxide and hydrogen peroxide in hypertension induced by an antagonist of adenosine receptors〔J〕.Eur J Pharmacol，2008;588(2-3):267-76.

7 Green LC，Wagner DA，Glogowski J，et al.Analysis of nitrate，nitrite，and〔15N〕nitrate in biological fluids〔J〕.Anal Biochem，1982;126(1):131-8.

8 Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding〔J〕.Anal Biochem，1976;72(2):248-54.

9 Endo S，Mori T，Yoneki Y，et al.Blockade of angiotensin II type-1 receptor increases salt sensit ivity in Sprague-Dawley rats〔J〕.Hypertens Res 2009;32(6):513-9.

10 Pechánová O，Jendeková L，Vranková S.Effect of chronic apocynin treatment on nitric oxide and reactive oxygen species production in borderline and spontaneous hypertension〔J〕.Pharmacol Rep，2009;61(1):116-22.

11 Beckman JS，Koppenol WH.Nitric oxide，superoxide，and peroxynitrite:the good，the bad，and ugly〔J〕.Am JPhysiol，1996;271(5-1):C1424-37.

12 Zhan CD，Sindhu RK，Pang J，et al.Superoxide dismutase，catalase and glutathione peroxidase in the spontaneously hypertensive rat kidney:effect of antioxidant-rich diet〔J〕.JHypertens，2004;22(10):2025-33.

13 Peixoto EB，Pessoa BS，Biswas SK，et al.Antioxidant SOD mimetic prevents NADPH oxidase-induced oxidative stress and renal damage in the early stage of experimental diabetes and hypertension〔J〕.Am JNephrol 2009;29(4):309-18.

14 B?umer AT，Krüger CA，F(xiàn)alkenberg J，et al.The NAD(P)H oxidase inhibitor apocynin improves endothelial NO/superoxide balance and lowers effetively blood pressure in spontaneously hypertensive rats:comparison to calcium channel blockade〔J〕.Clin Exp Hypertens 2007，29(5):287-99.

15 Paliege A，Pasumarthy A，Mizel D，et al.Effect of apocynin treatment on renal expression of COX-2，NOS1，and renin in Wistar-Kyoto and spontaneously hypertensive rats〔J〕.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2006;290(3):R694-700.

16 Awolesi MA，Sessa WC，Sumpio BE.Cyclic strain upregulates nitric oxide synthase in cultured bovine aortic endothelial cells〔J〕.J Clin Invest，1995;96(3):1449-54.

17 Grumbach IM，Chen W，Aguilar Mertens S，et al.A negative feedback mechanism involving nitric oxide and nuclear factor kappa-B modulates endothelial nitric oxide synthase transcription〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2005;39(4):595-603.

18 Drummond GR，Cai H，Davis ME，et al.Transcriptional and posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase expression by hydrogen peroxide〔J〕.Circ Res 2000;86(3):347-354.