劉 蕾 陳 光 王躍新 王淑秋 張鵬霞 王柏欣 王 薇

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒(RVS)是一群分布十分廣泛的RNA病毒，可以感染呼吸道、心肌等，并造成流行性傳播〔1～3〕。翻白草(Potentilla discolor Bunge)，又名雞腿兒、雞腳草、天青地白、白頭翁、葉下白，為薔薇科委陵菜屬植物翻白草的全草，具有解毒、清熱、止血消腫和止痢的作用，可治療痢疾、瘧疾、肺癰、癤癰、咯血、崩漏、瘡癬?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究其具有降低血糖、抗病毒、抗菌和降低血脂〔4～6〕等豐富的藥理作用，且毒副作用低。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細(xì)胞株和RSV病毒株由佳木斯大學(xué)病理生理學(xué)教研室保存。翻白草油由本實(shí)驗(yàn)室提取，血清、RPMI1640培養(yǎng)液、雙抗(青霉素-鏈霉素)均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;β-actin、兔源Bcl-2多克隆抗體、兔源Bax和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司;脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞株在10%RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)，37℃，5%CO2培養(yǎng)，約80%以上融合時(shí)取0.25%胰蛋白酶－0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，傳代。

1.2.2 藥物配制 用細(xì)胞維持液(含2%胎牛血清)將翻白草油(65.6 mg/ml)按1∶20、1∶40等比例進(jìn)行2倍倍比稀釋，0.22μm濾器抽濾除菌，4℃條件下保存。

1.2.3 病毒毒力測(cè)定 病毒毒力用50%細(xì)胞感染量(CCID50)表示。將 RSV液從10－1～10－10做10倍系列稀釋。將各稀釋度的RSV液接種HeLa細(xì)胞，設(shè)陰性對(duì)照，且每一稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3～5 d，觀察和記錄細(xì)胞病變(CPE)。CCID50用Reed-Muench法求出。

1.2.4 翻白草油對(duì)HeLa細(xì)胞毒性測(cè)定 將不同濃度的翻白草油分別加入HeLa細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度重復(fù)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)觀察3 d，記錄細(xì)胞形態(tài)變化。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，吸棄培養(yǎng)板中液體，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，去上清后每孔加DMSO 200μl，微量振蕩器振蕩5 min，酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(波長(zhǎng)490 nm)測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 翻白草油抗RSV的作用方式 每一濃度設(shè)4個(gè)培養(yǎng)瓶，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照。(1)藥物配制:用2%RPMI1640維持液(含2%胎牛血清)將翻白草油進(jìn)行稀釋濃度為0.1、0.025、0.006 3 mg/ml，0.22 μm 微孔濾器抽濾除菌，4℃ 保存?zhèn)溆谩?2)100 CCID50RSV病毒液配制:用2%RPMI1640維持液將RSV病毒原液1 000倍稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?3)對(duì)RSV的直接滅活作用:不同濃度的翻白草油分別與100 CCID50RSV液等量混合，37℃作用2 h后，將其接種HeLa細(xì)胞，37℃吸附2 h后，棄上清，加5 ml維持液。(4)在生物合成階段對(duì)RSV的作用:在長(zhǎng)成單層Hela細(xì)胞上，接種0.5 ml的100 CCID50RSV病毒病毒液，37℃吸附2 h，棄病毒液，加入不同濃度的翻白草油5 ml。不同濃度的翻白草油分別與100 CCID50RSV液等量混合，立即加入HeLa細(xì)胞中，37℃，吸附2 h后，棄培養(yǎng)瓶液體，加入維持液5 ml。(6)藥物對(duì)細(xì)胞預(yù)處理作用:預(yù)先加入不同濃度的翻白草油5 ml于HeLa細(xì)胞，37℃條件下，作用4 h后，PBS洗3次后，加入100 CCID50RSV液0.5 ml，37℃條件下，吸附2 h，棄RSV液上清，加入細(xì)胞維持液5 ml。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影響 裂解細(xì)胞樣品，測(cè)定蛋白含量，100℃、5 min蛋白變性，經(jīng)100 V、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，260 mA電轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)緩沖液漂洗。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，TBST漂洗，Bcl-2蛋白或Bax蛋白兔源多克隆抗體4℃過(guò)夜孵育，TBST漂洗，HRP標(biāo)記二抗37℃，90 min，TBST漂洗。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色試劑顯色，對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將結(jié)果進(jìn)行拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的凈光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方差分析調(diào)用Proc GLM過(guò)程，組間比較采用Dunnet t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RSV毒力測(cè)定 用普通光學(xué)倒置顯微鏡觀察CPE，與HeLa細(xì)胞對(duì)照組相比，RSV作用的HeLa細(xì)胞收縮變圓，典型串珠樣改變。72 h后，CPE陽(yáng)性細(xì)胞為50%HeLa細(xì)胞出現(xiàn)病變;CPE陰性細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞病變。通過(guò)Reed-Muench法計(jì)算RSV液對(duì)HeLa細(xì)胞的毒力為105.8CCID50/L，本實(shí)驗(yàn)病毒攻擊量為103CCID50/L。

2.2 翻白草油對(duì)宿主Hela細(xì)胞毒性作用 翻白草油對(duì)宿主HeLa細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞增殖緩慢、細(xì)胞皺縮變圓、顆粒增多、折光性增強(qiáng)、部分細(xì)胞出現(xiàn)破碎脫落等，HeLa細(xì)胞活力隨著翻白草油濃度的降低，逐漸增加，翻白草油的最小毒性濃度是0.10 mg/L。見(jiàn)圖1。

2.3 Western印跡檢測(cè)翻白草油對(duì)RSV感染宿主HeLa細(xì)胞Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響 翻白草油(除翻白草油預(yù)處理作用方式)組與病毒組比較，宿主HeLa細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討論

植物揮發(fā)油的主要成分是倍半萜烯、萜烯、酯和醇等。研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗癌、抗菌和抗病毒等多種藥理作用〔7〕，因此，植物揮發(fā)油的研究日益受到人們的重視。翻白草油是傳統(tǒng)中藥翻白草的揮發(fā)油，是傳統(tǒng)中藥，性味苦，平。翻白草應(yīng)用歷史悠久，《本草綱目》和《救荒本草》等醫(yī)藥典籍記載，功用主要為治痢疾、瘡疥、祛風(fēng)濕和解毒等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)翻白草具有降低血糖、血脂和抗病毒、抗菌等多種藥理作用。但抗RVS作用的研究較少。

細(xì)胞凋亡是生命的基本特征之一，一種由基因調(diào)控的而使細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡過(guò)程，是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、生理及病理性死亡的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖共同維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。細(xì)胞增殖與凋亡失控導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。凋亡一般由細(xì)胞外的調(diào)節(jié)因素與其在細(xì)胞表面的受體結(jié)合而啟動(dòng)。

Bax/Bcl-2系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是目前研究較為深入的有關(guān)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展取決于促凋亡與抑凋亡成員間的相對(duì)濃度，Bax和Bc1-2是Bcl-2癌基因家族中功能相反的兩個(gè)重要成員，分別為促凋亡類蛋白抗凋亡類蛋白，Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞是否進(jìn)入內(nèi)源性凋亡途徑，當(dāng)Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡途徑，反之，則不能進(jìn)入〔8〕。Bax在正常細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞質(zhì)，在凋亡刺激因子的作用下，可以發(fā)生轉(zhuǎn)位與線粒體相互作用，破壞線粒體膜的完整性，使線粒體內(nèi)某些促凋亡分子外流，進(jìn)而活化基質(zhì)金屬蛋白酶(caspase-9)，激活caspases-3分子，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程〔9〕。Bc1-2在線粒體外膜和 bax結(jié)合形成異構(gòu)二聚體阻止bax對(duì)線粒體的損傷，以維持線粒體膜的完整性，抑制細(xì)胞凋亡Bax/Bcl-2系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔10〕。病毒感染與宿主細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系，病毒感染宿主細(xì)胞后，通過(guò)各種機(jī)制參與宿主細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)〔11，12〕，

本研究結(jié)果提示RSV可能通過(guò)抑制凋亡抑制基因 Bcl-2的表達(dá)，增加凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)，導(dǎo)致caspase-3被激活，通過(guò)內(nèi)源性(線粒體途徑)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。另外，在三種作用方式下翻白草油抗RSV作用可能與抑制RSV引起的宿主細(xì)胞凋亡有關(guān)。翻白草油抗RSV病毒中線粒體途徑起主要作用，但對(duì)于該過(guò)程具體的調(diào)控機(jī)制、相關(guān)的分子機(jī)制以及是否涉及其他信號(hào)分子，可能還有其他途徑參與，還需做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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