馬 倩 耿 倩 薛 茜 鄒玉安

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

缺血性腦血管病(ICVD)患者總?cè)藬?shù)可達(dá)500萬～600萬，存活者有約75%的高致殘率〔1〕。目前認(rèn)為凋亡是遲發(fā)性腦死亡的主要形式，凋亡在腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察康腦液對腦缺血再灌注(I/R)大鼠的保護(hù)作用，從細(xì)胞凋亡因子Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)的角度研究其作用機(jī)制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 康腦液:由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等組成，藥材購于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，冷水浸泡30 min，文火煎煮3次，每次15 min，濾出藥渣，將2次煎取的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液(每毫升含生藥4 g、2 g、1 g)，最后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。依達(dá)拉奉注射液，規(guī)格:20 ml/30 mg，批號:061218，南京先聲東元制藥有限公司提供，4%多聚甲醛，購自美國 Sigma公司。兔抗大鼠 Fas、Caspase-3一抗體及相應(yīng)二抗(江蘇鎮(zhèn)江生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 自動脫水機(jī)(美國Thermo)，電腦生物組織包埋機(jī)(浙江金華科迪)，石蠟切片機(jī)(美國Thermo)，電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江金華科迪)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUSBX60型)，顯微攝影裝置(日本NIKON)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 SPF級雄性SD大鼠126只，體重200～280 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心〔許可證號SCXK(京)2006-0008〕。隨機(jī)分為:假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組(2.7 mg/kg)、康腦液高(24.0 g·kg－1·d－1)、中(12.0 g·kg－1·d－1)、低(6.0 g·kg－1·d－1)劑量組，假手術(shù)組 6 只，其余各組每組24只，術(shù)前7 d開始灌胃給藥，最后一次給藥后60 min實(shí)施腦I/R手術(shù)，每天早晨給藥1次，術(shù)后繼續(xù)給藥，直至處死。給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，假手術(shù)組及模型組灌等體積蒸餾水。采用改良Longa線栓法，制備大鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)模型。

1.4 Fas、Caspase-3蛋白檢測 各組大鼠分別于再灌注時間點(diǎn)后取腦，7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，首先用0.9%生理鹽水150 ml心臟灌注，直至沖出的液體變清亮后立即換用4%多聚甲醛心臟灌注固定，大鼠全身僵硬后快速斷頭取腦，從前向后將腦組織分為5等分，切成2～3 mm的腦片，4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h。常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。切片3μm，采用免疫組織化學(xué)(S-P二步法，按說明操作)檢測Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0進(jìn)行處理，每組數(shù)據(jù)以表示。各指標(biāo)組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織Fas蛋白表達(dá)結(jié)果 光鏡下(×400)在梗死周邊區(qū)隨機(jī)選取5個互不重疊視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。免疫組化染色顯示，F(xiàn)as主要分布在細(xì)胞質(zhì)，著色為棕黃色。與假手術(shù)組比較，模型組Fas蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.01)。與模型組比較，康腦液各組、依達(dá)拉奉組Fas蛋白表達(dá)明顯下降(P ＜0.01，P ＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 光鏡下(×400)在梗死周邊區(qū)隨機(jī)選取5個互不重疊視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。免疫組化染色顯示，Caspase-3主要分布在細(xì)胞質(zhì)，著色為棕黃色。與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.01)。與模型組比較，康腦液各組、依達(dá)拉奉組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。見表2，圖2。

表1 各大鼠Fas的表達(dá)結(jié)果(n=6

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

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表2 各組大鼠Caspase-3的表達(dá)結(jié)果(n=6

表2 各組大鼠Caspase-3的表達(dá)結(jié)果(n=6

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3 討論

I/R損傷涉及許多復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，包括許多環(huán)節(jié)，如興奮性氨基酸的毒性作用，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、線粒體功能障礙、炎性介質(zhì)的釋放，凋亡基因的表達(dá)等〔2〕。這些因素緊密聯(lián)系，互為因果、最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死。細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元細(xì)胞的主要死亡方式，其中促凋亡因子Fas、Caspase-3的表達(dá)與凋亡關(guān)系密切。Fas參與了腦缺血再灌注的病理生理過程〔3〕。Caspase-3的活化在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，因此抑制Caspase-3蛋白表達(dá)可阻斷細(xì)胞凋亡的瀑布反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時間點(diǎn)大鼠Fas和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)不明顯。在壞死邊緣區(qū)，模型組各時間點(diǎn)Fas和Caspase-3細(xì)胞數(shù)不同程度增加?？的X液各組能減少梗死灶周邊細(xì)胞Fas和Caspase-3表達(dá)，因此可以促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)。

從中醫(yī)角度來講腦血管病的主要病機(jī)為“氣虛血瘀”，治療原則應(yīng)以“益氣活血化瘀”為主?？的X液為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由補(bǔ)陽還五湯化裁而來，由黃芪、丹參、鉤藤、三七粉等組成，具有益氣活血化瘀、清熱平肝、熄風(fēng)定驚的作用。研究證實(shí)益氣活血法〔4，5〕對缺血性腦血管病能夠起到治療作用。張運(yùn)克等〔6〕證實(shí)補(bǔ)陽還五湯能夠抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦組織。各單藥黃芪〔7〕，鉤藤〔8〕，三七〔9〕等有不同的治療腦梗死的作用，因此研究康腦液的作用機(jī)制給腦血管病患者帶來了希望。

綜上，康腦液通過抑制早期Fas蛋白的表達(dá)，進(jìn)而阻斷Caspase-3引起的凋亡瀑布反應(yīng)，從而保護(hù)腦組織。

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3 吳 剛，薛榮亮，呂建瑞，等.全腦缺血再灌注后Fas、TNFR1蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及Bcl-2過度表達(dá)對其的影響〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011;31(8):1298-303.

4 李 凈，王 鍵，胡建鵬，等.益氣活血法對氣虛血瘀腦缺血再灌注損傷大鼠一氧化氮含量和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007;13(12):898-900.

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6 張運(yùn)克.補(bǔ)陽還五湯及拆方對腦缺血再灌注SD大鼠模型細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2007;22(6):404-7.

7 任 非，龔淑英，智麗敏，等.黃芪治療缺血性腦損傷的有效性〔J〕.中國臨床康復(fù)，2006;10(3):149-51.

8 唐映紅，張淑萍，梁 燕，等.三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注后白細(xì)胞介素21β和其相關(guān)因子及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶表達(dá)的影響〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2007;5(3):328-32.

9 高麗娜，宋 宇，徐 薇，等.鉤藤堿對缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用〔J〕.藥學(xué)與臨床研究，2009;17(1):1-4.