朱登祥 安 芳 王書(shū)華

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

金蓮花的現(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花總黃酮是其有效成分，前期研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花總黃酮具有抗腫瘤作用〔1～3〕，目前在臨床上主要用于抗菌抗病毒的治療。金蓮花黃酮單體葒草苷和牡荊苷具有抗氧化作用〔4，5〕。葒草苷和牡荊苷在金蓮花中含量較高〔6〕，與抗腫瘤作用較強(qiáng)的木犀草素及芹菜素〔7〕具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本研究擬進(jìn)一步觀察葒草苷和牡荊苷對(duì)人食管癌EC-109細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(Spectra Max，美國(guó)分子儀器有限公司);凝膠成像系統(tǒng)(BioSpectrumAC system，美國(guó)UVP公司);流式細(xì)胞儀(FCM，F(xiàn)ACS-Aria美國(guó)BD公司);ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司);3319型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司);電子天平ME235S(德國(guó));SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);TDL-40B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);DK-8A型電熱恒溫水浴槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DH4000A型電熱恒溫箱(泰特)

1.2 藥品與試劑 EC-109細(xì)胞(購(gòu)自北京腫瘤研究所遺傳室，后經(jīng)河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室傳代凍存);細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);CCK-8試劑盒(上海瑪芝佳公司);細(xì)胞凋亡Hoechst染色試劑盒(晶美生物工程有限公司);Annexin V-FITC試劑盒(碧云天試劑公司);胰蛋白酶(華北制藥集團(tuán));二甲亞砜(DMSO)(北京化學(xué)試劑廠);瓊脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 培養(yǎng)液用前加入10%FCS、100 U/ml慶大霉素，用碳酸氫鈉調(diào)pH值7.2～7.4。消化液為0.25%胰酶+0.02EDTA(1∶3)混合。人食管癌EC-109細(xì)胞于37℃飽和濕度、5%CO2條件下，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞貼壁呈梭狀生長(zhǎng)、透亮，表明細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞占瓶底約80%左右時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分空白組(加等量的培養(yǎng)液);溶劑對(duì)照組(加入含DMSO的培養(yǎng)液，使DMSO終濃度為0.2%，葒草苷和牡荊苷不溶于水，DMSO為助溶劑);藥物組(葒草苷和牡荊苷終濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)。

1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率檢測(cè) 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8法。以0.22μm濾器除菌儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用時(shí)以RPMI1640培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC-109細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，取100μl單細(xì)胞懸液加入96孔板，使每孔細(xì)胞1×105個(gè)，待細(xì)胞貼壁后，輕輕吸去上清，按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物。每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入藥物后，培養(yǎng)至24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8 液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算藥物對(duì)癌細(xì)胞的平均抑制率。

1.6 Hoechest33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài) EC-109細(xì)胞以每孔900μl(含5×103細(xì)胞)接種于24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)6 h，細(xì)胞貼壁后加入100μl不同處理因素，使葒草苷、牡荊苷終濃度為5.0、20.0、80.0μmol/L。空白組不含處理因素。培養(yǎng)48 h后Hoechst33258染色，以紫外光340 nm波長(zhǎng)激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA Ladder 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml接種于20 ml的培養(yǎng)瓶(2.5 ml/瓶)，待細(xì)胞貼壁后，加入藥物。葒草苷、牡荊苷終濃度為5.0、20.0、80.0μmol/L，設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，最后1次移入1.5 ml EP管中，加裂解液615μl，70℃水浴振蕩15 min，重復(fù)2次，離心取上清液500μl加1 000μl的無(wú)水乙醇使DNA析出，離心后用20μl TE緩沖液(pH7.4)溶解DNA。按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳前用RNA酶(10 g/L)消化30 min，2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡 實(shí)驗(yàn)分組及藥物作用時(shí)間同1.7，每組設(shè)置5個(gè)平行樣。收集對(duì)照組及不同濃度藥物組作用的EC-109細(xì)胞，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個(gè)，離心，棄上清，用冷PBS洗滌2次，按照流式試劑盒的說(shuō)明分別加入185μl緩沖液，10μl Annexin V和5μl PI，混勻避光20 min，離心后棄去上清，再加入冷PBS洗滌1次，用400μl PBS懸起細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(FACS-Aria)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用DMSO對(duì)細(xì)胞活性及增殖幾乎沒(méi)有影響，最大抑制率沒(méi)有超過(guò)1%，后面實(shí)驗(yàn)不再設(shè)試劑對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一時(shí)相，不同濃度葒草苷和牡荊苷均對(duì)EC-109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率隨著用藥濃度的增高而增高(P＜0.05)，不同時(shí)相，同一濃度葒草苷和牡荊苷均對(duì)EC-109細(xì)胞抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P＜0.05)。在不同時(shí)相，相同濃度的葒草苷對(duì)EC-109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率均高于同濃度的牡荊苷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用，n=5，%)

表1 葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用，n=5，%)

與同時(shí)點(diǎn)下一濃度組比較:1)P＜0.05;與同濃度下一時(shí)點(diǎn)比較:2)P＜0.05，與同濃度同時(shí)點(diǎn)牡荊苷比較:3)P＜0.05，下表同

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2.2 Hoechest33258熒光標(biāo)記NDA細(xì)胞核形態(tài)觀察 細(xì)胞核形態(tài)觀察，空白對(duì)照組細(xì)胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，在紫外線下呈均一的藍(lán)色熒光，可見(jiàn)處于分裂期的細(xì)胞。經(jīng)葒草苷、牡荊苷處理的細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，即胞體縮小，核染色質(zhì)染色明亮，出現(xiàn)波紋樣折縫狀，至核濃縮、分葉、邊集、核染色質(zhì)碎裂。隨著藥物濃度增大，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多。相同濃度的葒草苷作用強(qiáng)于牡荊苷，見(jiàn)圖1、圖 2。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 空白對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)梯形DNA條帶，而葒草苷和牡荊苷80.0μmol/L組，出現(xiàn)明顯條帶20.0μmol/L、5.0μmol/L藥物組的條帶模糊、變暗，但也有較明顯的效果，相同濃度的葒草苷比牡荊苷的DNA帶稍亮一些，但差異不很明顯。見(jiàn)圖3。

2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度葒草苷和牡荊苷均可誘導(dǎo)EC-109細(xì)胞凋亡，其凋亡率隨濃度的增大而增加。不同濃度葒草苷之間以及不同濃度牡荊苷之間凋亡率相比較均有顯著性差異(P＜0.05);較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)。80.0μmol/L葒草苷誘導(dǎo)EC-109細(xì)胞凋亡率為28.03%而同濃度牡荊苷為12.38%(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞凋亡的影響，n=3，%)

表2 不同濃度葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞凋亡的影響，n=3，%)

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3 討論

本研究提示，理想的藥物作用濃度應(yīng)該在5.0～80.0μmol/L之間，癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖被抑制，若引起早期凋亡，在48 h檢驗(yàn)效果較好。所以后面的3個(gè)檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，藥物作用時(shí)間定在48 h。等濃度的葒草苷對(duì)EC-109細(xì)胞抑制率要明顯高于牡荊苷，近乎2倍，這可能與葒草苷化學(xué)結(jié)構(gòu)中B環(huán)上3'、4'位置上有2個(gè)鄰位羥基，而牡荊苷化學(xué)結(jié)構(gòu)中B環(huán)上4'位置上只有1 羥基有關(guān)〔8〕。

在細(xì)胞早期凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)NDA可控制降解，形成不同長(zhǎng)度的核酸片段，這和細(xì)胞壞死，DNA降解不同，所以DNA條帶的出現(xiàn)，意味著凋亡的發(fā)生。本研究提示，葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)機(jī)制可能是觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致DNA可控裂解，細(xì)胞縊縮，在體外培養(yǎng)情況下，最終細(xì)胞死亡。綜上分析，葒草苷和牡荊苷對(duì)EC-109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有明顯抑制作用，并能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。相同濃度葒草苷作用強(qiáng)于牡荊苷。

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