王英杰 柴錫慶 黃冬霞 李文勝 安小蕾 王書(shū)秀 王文勝

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017)

生理情況下，細(xì)胞凋亡參與調(diào)節(jié)體內(nèi)正常細(xì)胞的更新和異常細(xì)胞的清除，對(duì)于確保細(xì)胞增殖與更新之間的平衡、維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定起著重要作用〔1〕。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是阿爾茨海默病(AD)等退行性疾病發(fā)展過(guò)程中的重要事件〔2～4〕，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞是不可逆的，但處于凋亡過(guò)程中的神經(jīng)細(xì)胞存在不同程度的可逆性。本實(shí)驗(yàn)觀察旋覆花素對(duì)Aβ海馬內(nèi)注射誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織凋亡相關(guān)基因變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):611071)，鼠齡 10～12月齡，體重(364.5±15.0)g，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和旋覆花素給藥組，每組10只。給藥組術(shù)前 3 d及術(shù)后每天用旋覆花素26 mg·kg－1·d－1灌胃，共21 d。模型組用旋覆花素的溶劑吐溫80水溶液同法處理。

1.2 試劑與儀器 旋覆花素由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離制備，含ABL 2.66 g/L。Aβ25～35購(gòu)自Sigma公司;Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;腦立體定向儀:江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠制造。

1.3 Aβ25～35的孵育 用無(wú)菌生理鹽水將 Aβ25～35稀釋成10 g/L，37 ℃孵育72 h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的 Aβ25～35，置于在4℃冰箱備用。

1.4 藥物海馬內(nèi)注射方法 大鼠用質(zhì)量濃度為20 g/L烏拉坦60 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜〔2〕，以前囟為零點(diǎn)，于前囟后 3.5 mm，中線右側(cè)旁開(kāi)2 mm，為穿刺點(diǎn)，用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，以微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針3 mm，分別于雙側(cè)海馬CA1區(qū)于5 min內(nèi)緩慢注射 Aβ25～35各 1 μl(10 μg)，5 min緩慢注入，留針5 min，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，退針縫合傷口。術(shù)前3 d及術(shù)后18 d，給藥組給旋覆花素 26 mg·kg－1·d－1分兩次灌胃，模型組給予等量溶劑。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 參照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、石蠟垂直包埋，間斷均勻切片，切片厚約 10μm，采用SABC方法進(jìn)行免疫組化染色。分別以抗Bax(1∶200)、抗 Bcl-2(1∶200)抗體為一抗，其他操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒作為判定陽(yáng)性染色的標(biāo)準(zhǔn)。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.6 Western印跡分析 各組取等量蛋白提取液，Bax為80μg，Bcl-2約為80μg，經(jīng) 12%SDS-PAGE電泳分離后，于半干轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉封閉，分別與抗Bax抗體(1∶200)、抗 Bcl-2抗體(1∶200)在 4℃條件下反應(yīng)過(guò)夜。然后與HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶10 000)室溫反應(yīng)2 h，室溫條件下用TTBS、TBS充分震蕩洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法顯影。用美國(guó)Kodak公司ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。采用美國(guó)Kodark公司數(shù)碼成像分析軟件對(duì)Western印顯色區(qū)帶的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料以表示，組間資料應(yīng)用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織Bax基因表達(dá)的影響 模型組大鼠腦海馬組織中Bax表達(dá)顯著增強(qiáng)，染色細(xì)胞數(shù)量多，著色深。應(yīng)用旋覆花素治療后，染色細(xì)胞數(shù)量減少，著色變淺(圖1)。模型組大鼠腦海馬組織 Bax表達(dá)明顯較對(duì)照組高，給予旋覆花素治療后，給藥組大鼠腦海馬組織 Bax表達(dá)下降(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.2 旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織Bcl-2基因表達(dá)的影響 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組海馬組織相比，模型組和旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織的染色無(wú)明顯加深，染色細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增多。Western印跡顯示，對(duì)照組大鼠腦海馬組織Bcl-2表達(dá)量與模型組及旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織表達(dá)量無(wú)明顯差別(P＞0.05)，提示旋覆花素對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織的Bcl-2基因的表達(dá)影響不大。

3 討論

Bcl-2屬凋亡抑制基因而B(niǎo)ax為凋亡促進(jìn)基因。NO及其代謝產(chǎn)物NO2、羥基自由基等可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損害。NO誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性表現(xiàn)在Bcl-2減少、Bax增多以及caspase活化〔5〕。Nie等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)人參環(huán)氧炔醇和人參醇可以抑制NO增高引起的腦皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡，其機(jī)制可能為促進(jìn)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)?？咕袷СＫ庎蚱娇筛纳艫PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)損害，抑制β分泌酶(BACE1)表達(dá)及活性，減少Aβ沉積，同時(shí)Bcl-2表達(dá)增加，推測(cè)上述改變與Bcl-2的作用有關(guān)〔7〕。而體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Aβ42可通過(guò)升高Bax/Bcl-2比率引起人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡〔8〕。Bcl-2和Bax在AD中有著關(guān)鍵作用〔9〕。本實(shí)驗(yàn)提示旋覆花素主要通過(guò)抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，發(fā)揮其抑制Aβ海馬內(nèi)注射誘導(dǎo)AD模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。旋覆花素主要通過(guò)抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，從而抑制Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，而對(duì)凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)影響不大。

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