胡仁統(tǒng)，張學榮，徐 瑾，羅小玲，林 興，廖 明

(廣西醫(yī)科大學1.醫(yī)學科學實驗中心、2.附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧 530021)

多年來對肝纖維化的研究越來越深入，但是缺乏理想的治療方案。目前針對肝纖維化的藥物治療主要還是在離體和動物模型實驗中顯示具有一定的療效，其中包括作用于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和細胞因子的藥物［1］、抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的藥物如干擾素［2］及抗氧化劑［3］等。但讓眾多研究者困惑的是幾乎所有的抗肝纖維化藥物在離體細胞以及動物模型中具有一定的效果而在臨床上無效或效果比較差，這導致了這些抗肝纖維化藥物很難在臨床應(yīng)用與治療。因為肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一種多途徑、多因素參與的過程，主要病理改變是ECM的過度合成與異常沉積。HSC是參與肝纖維化的最重要細胞，HSC的活化、增殖被認為是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，而抑制HSC增殖、誘導其凋亡成為抗肝纖維化的重要策略［4］。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的典型代表［5］，其在神經(jīng)領(lǐng)域的應(yīng)用已被公認。近年來NGF誘導HSC細胞凋亡的發(fā)現(xiàn)為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了一個新的靶點。眼鏡蛇毒中富含NGF，而且分離純化NGF不僅得率較高，還具有耐堿、耐酸、耐蛋白酶水解及穩(wěn)定性高等的特點，廣西是眼鏡蛇的主要產(chǎn)地，充分開發(fā)這一資源具有重要的研究意義。因此，本實驗通過流式細胞術(shù)、雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的方法，在細胞水平探討NGF對HSC-T6細胞增殖、凋亡作用以及細胞中與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的表達差異，為進一步揭示肝纖維化的發(fā)展機制及NGF抗肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器眼鏡蛇蛇毒NGF由廣西醫(yī)科大學蛇毒研究所提供;大鼠肝星狀細胞HSC-T6購于湖南湘雅醫(yī)學院;大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC-12)購于上海中科院細胞研究所;胎牛血清、馬血清、F12培養(yǎng)基、MTT購自Sigma公司;高糖DMED培養(yǎng)基購自HYCLONE公司;PC-12細胞用含體積分數(shù)為10%胎牛血清+5%馬血清+1%的雙抗的F12K培養(yǎng)液;HSC-T6細胞用含體積分數(shù)為10%胎牛血清+1%雙抗的高糖DMED培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。雙向電泳所用試劑主要購自Promega公司，17 cm固相pH梯度(IPG)干膠條(pH 3～10)、IPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALT Six垂直電泳儀、高分辨的圖像掃描儀和凝膠斑點采集儀(Picker)購于BIO-RAD公司。所有試劑以去離子水配置。

1.2實驗方法

1.2.1眼鏡蛇毒NGF活性鑒定 將生長良好的PC-12細胞以每毫升5×105個細胞的濃度接種于24孔板。待細胞貼壁后吸掉培養(yǎng)基，加入眼鏡蛇NGF，并換用低濃度血清培養(yǎng)液(體積分數(shù)為2%馬血清+5%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液)進行培養(yǎng)，使NGF終濃度為2 mg·L－1，培養(yǎng)時間為2～4 d，其間在普通顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.2MTT法檢測HSC-T6細胞的增值 取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的高糖DMED培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至每毫升2×105個，接種于96孔板。待培養(yǎng)細胞至貼壁后，加入 NGF。以不同濃度 NGF(1、2、5、10、20 mg·L－1)分組，同時設(shè)置未加任何藥物的空白對照組，每組設(shè)6個復孔。作用24 h后，每孔加5 000 mg·L－1的 MTT 貯存液 20 μl，孵育 4 h，棄上清并每孔再加150 μl DMSO溶解細胞內(nèi)結(jié)晶，振蕩器上振蕩10 min，孵育10 min，酶標儀595 nm處測各孔吸光度。

1.2.3流式細胞儀觀察和測定HSC-T6細胞凋亡實驗設(shè)立空白對照組和NGF干預(yù)組，NGF濃度根據(jù)MTT結(jié)果選2、5 mg·L－1的NGF濃度進流式細胞儀實驗。將對數(shù)生長的HSC-T6細胞接種于6孔板，每孔2 ml，培養(yǎng)12 h細胞貼壁，吸掉培養(yǎng)基，用體積分數(shù)為5%胎牛血清的高糖DMED培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并加入NGF，在培養(yǎng)箱孵育24 h，胰酶消化離心收集細胞。用體積分數(shù)為2%BSA的PBS洗細胞兩次，加入300 μl流式上樣緩沖液、5 μl FITC 和 5 μl PI，均勻混合，避光反應(yīng)5～15 min。0.5 h內(nèi)上機檢測。

1.2.4雙向凝膠電泳細胞總蛋白的提取 取生長良好的HSC-T6細胞于25 ml培養(yǎng)瓶里進行培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)瓶的60% ～70%開始藥物作用，實驗分為空白對照組和NGF藥物作用組，NGF藥物濃度根據(jù)MTT實驗的結(jié)果以半數(shù)抑制率對應(yīng)的藥物濃度，用體積分數(shù)為5%胎牛血清的高糖DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物作用24 h后分別提取細胞總蛋白，同時每個組做3次平行實驗。提取出來的細胞總蛋白用3 ku的超濾管進行超濾以除鹽，然后用考馬斯亮藍法定量蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE電泳分析細胞總蛋白，并把蛋白質(zhì)等質(zhì)量分裝真空凍干機凍干備用。

1.2.5雙向凝膠電泳 使用17 cm IPG膠條(非線性)進行等電聚焦電泳，應(yīng)用膠內(nèi)泡脹法進行加樣，蛋白上樣量為500 μg左右。采用低電壓50 V，12 h主動水化。等電聚焦步驟如下:500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 5 h，待17 cm膠條等電聚焦總伏時達到60 000 V時結(jié)束聚焦。將膠條取出，在平衡液中進行兩步平衡，平衡后將膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE上，用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的低熔點瓊脂糖封膠后進行第二向電泳，電泳條件為每塊膠恒定電流10 mA，20 min后將電流加大到30 mA，待溴酚藍指示帶到達凝膠底部處結(jié)束電泳。

1.2.6銀染及圖像分析 SDS-PAGE凝膠使用固定液固定2 h以上，敏化液敏化30 min，用蒸餾水漂洗3次，每次15 min，然后銀染20 min，倒掉銀染液用蒸餾水漂洗2次，每次1 min，馬上加入顯色液晃動直到看到明顯的蛋白點，立刻用終止液進行終止反應(yīng)，最后用蒸餾水保存。然后通過GS-800凝膠掃描儀獲得數(shù)字化圖像，并用PD Quest 7.3軟件進行分析。

1.2.7差異蛋白質(zhì)點的鑒定 對表達差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點從凝膠上用槍頭挖出來，然后進行膠內(nèi)酶解，把酶解出來的蛋白質(zhì)多肽用Zip Tip脫鹽柱脫鹽，濃縮后與基質(zhì)1∶1比例混合，點在點板儀上，自然晾干后MALDI-TOF/TOF-MS檢測，鑒定差異蛋白質(zhì)。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，組間差異用t檢驗，以±s表示。圖譜分析由STATA 7.0統(tǒng)計分析軟件(State Corp，College Station，TX，USA)完成。

2 結(jié)果

2.1NGF性質(zhì)鑒定在空白對照組中PC12細胞體積縮小，細胞呈圓形或橢圓形，也有部分呈不規(guī)則形，無明顯突起。而NGF實驗組，可見PC12細胞長出多個神經(jīng)纖維樣的突觸，突觸數(shù)目不等，長短不一，有些交織成網(wǎng)狀，細胞的分化程度與NGF呈時間依賴性，見Fig 1。結(jié)果表明，NGF能誘導PC12細胞分化，并具有良好的生物學活性。

2.2NGF對HSC-T6細胞增殖的影響將不同濃度的NGF干預(yù)對數(shù)生長的HSC-T6，MTT結(jié)果顯示，與空白對照比較，NGF各劑量組均不同程度地抑制HSC-T6細胞的增殖，NGF濃度為1 mg·L－1時抑制率差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);5 mg·L－1差異效果變得比較明顯(P＜0.01)，抑制率先隨著NGF濃度的增加而變大，然后又開始減小，見Tab 1，說明NGF在一定濃度范圍內(nèi)具有抑制HSC-T6細胞增殖的作用。

Fig 1 Analysis of the activity of PC-12 cells treated with cobra venom NGF

Fig 2 HSC-T6 cells after the cobra venom NGF is added(detected by flow cytometry)

Tab 1 Effect of NGF on the proliferation of HSC-T6(±s)

Tab 1 Effect of NGF on the proliferation of HSC-T6(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·L－1The rata of inhibition/%Control group 0 23.8 ±1.8 NGF 1 25.1 ±2.1*2 38.5 ±2.0＊＊5 48.2 ±1.9＊＊10 67.8 ±2.3＊＊20 56.7 ±2.5＊＊

2.3NGF對HSC-T6細胞凋亡的影響經(jīng)流式細胞儀檢測顯示，空白對照組有少數(shù)細胞凋亡，而NGF干預(yù)組作用24 h后檢測不同濃度組均存在不同程度的凋亡。其中NGF濃度為2 mg·L－1時凋亡率(16.16% ±3.02%)，與空白對照組凋亡率(2.70%±1.55%)比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);當 NGF濃度升到 5 mg·L－1時，凋亡率為21.15%±3.31%，與對照組凋亡率比較差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，并且凋亡效果更加明顯，說明NGF可誘導HSC-T6細胞發(fā)生凋亡，見Fig 2。

2.4細胞總蛋白SDS-PAGE電泳圖SDS-PAGE電泳顯示空白對照組和NGF作用組細胞總蛋白的條帶非常多，分子量大小不一，看不出明顯的差異條帶，見 Fig 3。

2.5HSC-T6細胞的2-DE圖譜的建立及差異分析對空白對照組和NGF作用的實驗組HSC-T6細胞總蛋白進行雙向電泳，獲得2張電泳圖譜，空白對照的HSC-T6細胞和NGF作用的HSC-T6細胞的平均蛋白質(zhì)點分別為(668±28)個和(607±23)個，兩組之間的匹配率為90.9%。利用圖像分析軟件對蛋白圖譜進行差異分析篩選出差異表達的蛋白47個，其中在NGF作用HSC-T6中表達上調(diào)的25個，下調(diào)的22個。其中NGF組中箭頭標注為部分差異表達的蛋白質(zhì)點，見Fig 4。

Fig 3 SDS-PAGE electrophoresis

Fig 4 Two-dimensional electrophoresis

2.6質(zhì)譜鑒定結(jié)果對兩組中表達差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點13個，通過質(zhì)譜鑒定出13個蛋白質(zhì)肽譜圖，利用Peptidem查詢軟件搜索Mascot數(shù)據(jù)庫得到9個蛋白質(zhì)，有4個無法鑒定出結(jié)果。相對于無NGF干預(yù)的對照組，在NGF干預(yù)的實驗組中有4個表達上調(diào)(用“↑”表示)，有5個表達下調(diào)(用“↓”表示)，結(jié)果見Tab 2，這些蛋白質(zhì)主要參與細胞增殖、細胞凋亡、細胞代謝以及細胞信號傳導等相關(guān)途徑。

3 討論

隨著對肝病研究的不斷深入與發(fā)展，肝纖維化被認為是肝硬化、肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵而又必經(jīng)的過程。因此揭示肝纖維化發(fā)生發(fā)展機制以及抑制其發(fā)展成為預(yù)防和控制肝癌發(fā)展的重要途徑。近來研究表明，逆轉(zhuǎn)肝纖維化關(guān)鍵在于減少活化的HSC數(shù)量，而HSC的數(shù)量是由HSC增殖和凋亡共同決定的，從理論上講，減少活化HSC數(shù)量有這些途徑:抑制HSC的增殖;誘導HSC發(fā)生凋亡，直接減少HSC數(shù)量;逆轉(zhuǎn)活化的HSC細胞，讓其變回靜止型等。但研究表明抑制其增殖和誘導凋亡是減少活化型HSC數(shù)量的主要途徑［6］。近年來，有研究顯示NGF能抑制HSC細胞增殖并誘導其發(fā)生凋亡［7］。

本實驗用眼鏡蛇毒NGF對大鼠肝纖維化細胞株HSC-T6進行干預(yù)，MMT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF能明顯抑制HSC-T6的增殖(P＜0.05);并且，流式細胞術(shù)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)NGF能夠誘導HSC-T6細胞發(fā)生凋亡(P＜0.05)，說明NGF具有抑制HSC-T6細胞增殖以及誘導其凋亡的作用。這可能是NGF作用HSCT6細胞后，通過某些途徑參與抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡的過程。有體外實驗證明，NGF誘導HSCT6細胞凋亡主要是通過與細胞表面低親和力受體p75結(jié)合介導胞內(nèi)信號傳遞實現(xiàn)的，而促凋亡受體p75與抗凋亡因子TrkA在細胞凋亡過程中起著主要的作用［8］。

肝纖維化過程中基因并沒有發(fā)生改變，而是某些基因表達不足或者過度表達引起，對肝纖維化中那些激活并過度表達的膠原基因進行抑制或封閉，對治療肝纖維化具有廣闊的前景［9］。目前認為ECM是主要的膠原蛋白，其過度表達和異常沉積是肝纖維化發(fā)生的主要機制［10］。因此，研究肝纖維化過程中與其相關(guān)蛋白質(zhì)的變化對揭示肝纖維化的發(fā)生機制及抗肝纖維化藥物的研發(fā)具有主要的意義。雙向電泳(2-DE)作為研究蛋白質(zhì)組學一種傳統(tǒng)而又實用的技術(shù)，其操作簡單，并能夠在一個實驗系統(tǒng)中同時研究多種蛋白質(zhì)的變化，把這種技術(shù)應(yīng)用于肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，有助于全面闡明肝纖維化發(fā)生過程中各種蛋白質(zhì)的變化情況［11］。由于2-DE對蛋白中鹽濃度以及一些雜質(zhì)比較敏感，容易受到影響，從而使所得的蛋白圖譜分辨率較低。因此，為了得到分辨率更高、重復性更好的細胞蛋白2-DE技術(shù)方案，根據(jù)多年來在蛋白質(zhì)組學方面的實驗積累［12～13］，本實驗對樣品預(yù)處理方案和硝酸銀染色方法等進行了優(yōu)化，得到更為理想的細胞2-DE圖譜。

Tab 2 Differentially expressed protein

同時本課題應(yīng)用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，分析眼鏡蛇毒NGF干預(yù)前后HSC-T6細胞蛋白質(zhì)的差異表達，發(fā)現(xiàn)在兩張圖譜上相對應(yīng)的位置并沒有蛋白質(zhì)點完全沉默，而是相對表達上調(diào)或者下調(diào)。這也說明在肝纖維化過程中沒有發(fā)現(xiàn)基因的異常，而是某些基因過度表達或表達不足。質(zhì)譜鑒定出的差異的蛋白質(zhì)，通過功能分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與細胞代謝、細胞增殖、細胞凋亡、細胞信號傳導等相關(guān)途徑。特別是表達下調(diào)的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1和金屬蛋白酶組織抑制物TIMP-2，這是與肝纖維化相關(guān)性很緊密的蛋白，主要參與調(diào)節(jié)ECM合成和降解的作用。多項研究表明，TGF-β1是強有力的致纖維化細胞因子，在肝纖維化中表達明顯增多，可促進HSC的增殖和活化，使ECM合成增多，降解減少，并存在正反饋放大效應(yīng)，促進肝纖維化的進程［14］。而實驗組中發(fā)現(xiàn)TGF-β1是表達下調(diào)的，這可能是抑制肝纖維化的有利信號。還有些蛋白是酶類，主要參與細胞的代謝與氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程。說明改變細胞內(nèi)代謝及氧化應(yīng)激也可能是引起細胞發(fā)生凋亡的一個重要因素。

總之，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個多細胞參與、多途徑的復雜過程，本實驗用眼鏡蛇毒NGF干預(yù)HSC-T6細胞，在細胞水平上發(fā)現(xiàn)其能抑制HSC-T6細胞的增殖、誘導HSC-T6細胞凋亡以及使HSC-T6細胞中與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)表達發(fā)生改變，這提示我們蛇毒NGF可能成為一種新型的抗肝纖維化藥物。蛇毒NGF可能是通過上調(diào)或者下調(diào)與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)來實現(xiàn)抑制HSC-T6細胞的增殖、誘導HSC-T6細胞凋亡，從而達到抗肝纖維化的目的。而這些差異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和在整個抗肝纖維化網(wǎng)絡(luò)中的作用有待于進一步的研究。

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