田維軍 張 鑫 趙金偉 侯 波 (吉林省人民醫(yī)院急診外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

白細(xì)胞介素(IL)-1α是一種多功能細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成并分泌，不僅參與炎癥反應(yīng)，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示，IL-1α在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中明顯高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤血管形成，并且與結(jié)直腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移有關(guān)〔1〕。臨床實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)直腸癌患者血漿中IL-1α蛋白表達(dá)明顯升高〔2〕。迄今為止，尚未見(jiàn)結(jié)直腸癌中IL-1αmRNA的表達(dá)變化研究報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-1αmRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集手術(shù)切除結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本42例，其中男 25例，女 17例，年齡 45～69〔平均(57.1±12.4)〕歲。均經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌，手術(shù)切除組織立即液氮凍存。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用Trizol法(TRIpure Reagent購(gòu)自北京百泰克公司)提取結(jié)直腸癌組織及癌旁組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司)。參照文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)目的基因IL-1α引物:上游:5'-AGAAGAGACGGTTGAGTTTAAGCCAATCCA-3'，下游:5'-CTCAGGAAGCTAAAAGGTGCTGACCTA-3'，擴(kuò)增片段大小115 bp。內(nèi)參基因 GAPDH:上游引物:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。運(yùn)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，按照10、101、102、103和104梯度稀釋 cDNA，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用20μl反應(yīng)體系，含有cDNA模板2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μl，上、下 游 引 物(10 μmol/L)各0.2 μl，RNase-free水補(bǔ)足體積至 20 μl。設(shè)置反應(yīng)條件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，RNase-free水代替模板cDNA作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣本復(fù)孔2管，軟件自動(dòng)記錄Ct值。調(diào)整基線使目的基因IL-1α和內(nèi)參基因GAPDH閾值一致，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。以IL-1α相對(duì)表達(dá)量/GAPDH相對(duì)表達(dá)量，得到校正后每個(gè)待測(cè)樣本IL-1α的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，結(jié)直腸癌組織和癌旁組織IL-1αmRNA相對(duì)含量比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)直腸癌臨床特征之間的比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 熔解曲線分析:單峰，高而尖，無(wú)鋸齒狀，表明引物特異性較好，無(wú)非特異性擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析:目的基因和內(nèi)參基因的R2均＞0.98，表明直線擬合度較好;根據(jù)斜率，電腦自動(dòng)計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率，均＞90%。待測(cè)樣本之間具有可比性。

2.2 IL-1αmRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá) IL-1αmRNA在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)含量(1.18±0.80)明顯高于癌旁組織(0.74±0.49)(t=-3.12，P=0.003)。IL-1α mRNA 在臨床Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)含量明顯高于其Ⅰ～Ⅱ期(P=0.01);IL-1αmRNA在伴有轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)含量明顯高于其在無(wú)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中(P=0.002);IL-1α mRNA在不同分化程度結(jié)直腸癌中的表達(dá)無(wú)明顯差異。見(jiàn)表1。

表1 IL-1αmRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征的相關(guān)性(±s)

表1 IL-1αmRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征的相關(guān)性(±s)

臨床特征 n IL-1αmRNA相對(duì)含量 t值 P值24 1.06±0.71 -1.14 0.26低分化 18 1.34±0.90臨床分期 Ⅰ～Ⅱ 22 0.89±0.52 -2.67 0.01Ⅲ～Ⅳ 20 1.50±0.93轉(zhuǎn)移狀態(tài) 有 19 1.59±0.90 3.40 0.002無(wú)分化程度 高中分化23 0.84±0.50

3 討論

IL-1作為一種多向性細(xì)胞因子，不僅影響機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)，而且具有調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能，在急慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。IL-1家族包括2個(gè)成員:IL-1α和IL-1β，兩者通過(guò)與IL-1 I型受體結(jié)合，參與腫瘤的演變過(guò)程。IL-1β可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲〔4，5〕。外源性IL-1β干預(yù)結(jié)直腸細(xì)胞后，金屬基質(zhì)蛋白酶及其組織抑制劑基因表達(dá)明顯增加，這些基因的增加與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔6〕。IL-1β不僅與結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為有關(guān)，而且與患者性別有關(guān)，Sharma等〔7〕報(bào)道IL-1β在男性結(jié)直腸患者中的表達(dá)明顯高于女性。與IL-1β作用類似，過(guò)表達(dá)IL-1α可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成〔1，8〕。結(jié)直腸癌患者血漿中 IL-1α 蛋白表達(dá)明顯升高〔2〕。

本研究提示IL-1α有望作為結(jié)直腸癌發(fā)病新的生物學(xué)標(biāo)記物。關(guān)于IL-1α在結(jié)直腸癌發(fā)病中的作用機(jī)制，至今尚未完全闡明，推測(cè)IL-1αmRNA的異常升高導(dǎo)致了IL-1α蛋白表達(dá)增加，參與腫瘤惡變過(guò)程，介導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生。

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6 Kapral M，Wawszczyk J，Jurzak M，et al.The effect of inositol hexaphosphate on the expression of selected metalloproteinases and their tissue inhibitors in IL-1beta-stimulated colon cancer cells〔J〕.Int J Colorectal Dis，2012;27(11):1419-28.

7 Sharma A，Greenman J，Walker LG，et al.Differences in cytokine levels due to gender in colorectal cancer patients〔J〕.Cytokine，2010;50(1):91-3.

8 史新龍，馬家馳，楊熊飛，等.白細(xì)胞介素1α及其受體拮抗劑對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響〔J〕.中國(guó)普通外科雜志，2012;21(10):1231-5.