涂曉萌，段紅梅，饒家聲，楊朝陽，李曉光

·基礎(chǔ)研究·

堿性成纖維細(xì)胞生長因子-殼聚糖載體誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化①

涂曉萌1，段紅梅2，饒家聲1，楊朝陽2，李曉光1

目的探索堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)-殼聚糖載體對(duì)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用。方法采用免疫組織化學(xué)進(jìn)行定性觀察，并定量計(jì)數(shù)rMSCs誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞，噻唑藍(lán)(MTT)比色法定量檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞的活性。結(jié)果rMSCs經(jīng)bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)后，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin、神經(jīng)元標(biāo)記物β-tubulinⅢ和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，nestin在bFGF-殼聚糖組中高表達(dá)，9 d時(shí)達(dá)到最大值49.40%。結(jié)論bFGF-殼聚糖載體可以誘導(dǎo)成年rMSCs高比例地分化為神經(jīng)干細(xì)胞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；殼聚糖；神經(jīng)轉(zhuǎn)化；神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)元；星形膠質(zhì)細(xì)胞；大鼠

[本文著錄格式]涂曉萌，段紅梅，饒家聲，等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子-殼聚糖載體誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(10):916-921.

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)退行性疾病或損傷后遺留的神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其功能的修復(fù)始終是神經(jīng)學(xué)科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞移植在中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和損傷修復(fù)方面，有藥物和其他治療手段所達(dá)不到的療效，引起世界各國學(xué)者越來越多的關(guān)注[1]。干細(xì)胞因其具有高度自我更新和多向分化潛能性，是細(xì)胞移植的首選細(xì)胞。所以移植外源性干細(xì)胞重塑神經(jīng)組織是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種重要策略。然而干細(xì)胞的研究面臨著一些問題，如干細(xì)胞研究的技術(shù)問題：如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化；如何克服移植排斥反應(yīng)；如何避免形成腫瘤；還有倫理學(xué)問題等。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rMSCs)是一種存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細(xì)胞來源的細(xì)胞亞群，在一些化學(xué)物質(zhì)或細(xì)胞因子的作用下，不僅能夠分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞、肌細(xì)胞等中胚層細(xì)胞，而且可以跨越胚層的限制，橫向分化為外胚層起源的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，所以具有干細(xì)胞的兩個(gè)重要特征：自我更新和多向分化潛能[2]。rMSCs與其他干細(xì)胞相比具有來源豐富、容易分離、自體移植沒有免疫排斥反應(yīng)和不存在倫理問題等優(yōu)勢。

2011年，Ding等通過細(xì)胞重組技術(shù)，對(duì)現(xiàn)有的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，將成人皮膚細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)，所得到的神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，可以通過不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞[3]。目前，研究者絕大多數(shù)采用的誘導(dǎo)方法是在含有2%N2/B27的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)直接體外誘導(dǎo)rMSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，bFGF-殼聚糖載體能成功誘導(dǎo)7 d乳鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高比例分化為神經(jīng)元，高達(dá)83.54%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)此過程中有神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物nestin的表達(dá)[7]，在此基礎(chǔ)上，我們使用成年大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，探索其經(jīng)bFGF-殼聚糖載體的誘導(dǎo)后，定向轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的潛能及誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞類型,并通過神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)比使用成年和7 d乳鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

成年Wistar大鼠，200～220 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑：α-MEM培養(yǎng)基(Applichem)、nestin小鼠單克隆抗體(Chemicon,CA)、β-tubulinⅢ兔單克隆抗體(Chemicon,CA)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)兔單克隆抗體(Chemicon,CA)和四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(SIGMA)。

1.2 rMSCs的分離培養(yǎng)

用6%的水合氯醛0.006 ml/g麻醉大鼠，75%醫(yī)用酒精消毒，冰上解剖后肢；在不破壞股骨和脛骨的情況下，分離股骨和脛骨；使用PBS(0.01 mol/L)沖洗3遍；將股骨和脛骨放入含10%胎牛血清(澳洲.excell)的α-MEM培養(yǎng)基中，無菌注射器徹底沖洗骨髓腔；反復(fù)沖打骨髓細(xì)胞，使之成為單細(xì)胞懸液；按照1∶1比例，將骨髓細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液之上，1000 r/min，離心10 min；取沉淀細(xì)胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基吹散為單個(gè)細(xì)胞；以(1～3)× 106/ml的濃度接種到含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液的塑料培養(yǎng)皿中，在37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；24 h后全量換液，每3天全量換液1次；連續(xù)培養(yǎng)7 d后,當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿80%時(shí)，用0.25%胰酶+乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。

1.3 rMSCs的鑒定

rMSCs在連續(xù)培養(yǎng)到3代后對(duì)其進(jìn)行鑒定。用0.25%胰酶+EDTA從培養(yǎng)皿底部消化貼壁的rMSCs；4℃、1000 r/min離心5 min，棄上清；然后用PBS沖洗，4℃、1000 r/min離心5 min，棄上清；重復(fù)一次；保留約200 μl的PBS溶液，分別用PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD45單克隆抗體(BD Pharmingen)和FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD90(BD Pharmingen)單克隆抗體雙標(biāo)、FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD44單克隆抗體(BD Pharmingen)和PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD45單克隆抗體雙標(biāo)；冰上放置30 min后，用流式細(xì)胞儀(COULTER EPICS@XL,America)進(jìn)行檢測。

1.4 rMSCs的誘導(dǎo)分化

將傳代3次以上的rMSCs的細(xì)胞培養(yǎng)于鋪有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板內(nèi)，接種密度為(1～3)× 107/ml，分別加入不同的誘導(dǎo)劑：實(shí)驗(yàn)組1：單純殼聚糖(4 mg/ml)；實(shí)驗(yàn)組2：單純bFGF(25 ng/ml)；實(shí)驗(yàn)組3：bFGF-殼聚糖(4 mg/ml)；對(duì)照組：僅含有5 ml α-MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每隔3 d半量換液1次，連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月。

1.5免疫熒光染色

以上各組的細(xì)胞在誘導(dǎo)后3 d、5 d、7 d、14 d后，吸出培養(yǎng)基，PBS洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛，4℃固定40 min，PBS洗3次，每次5 min；0.2%PBST浸泡5 min，1%羊血清(0.2%PBST配制)在37℃封閉30 min；加入一抗：nestin(1∶100)，β-tubulinⅢ(1∶100)，GFAP(1∶50)，在37℃下孵育120 min；PBS洗3遍，每次5 min；加入熒光二抗(1∶100)，37℃避光孵育50 min，PBS洗3次，每次5 min，Hochest染核(1∶1500)，室溫下5 min，去離子水漂洗3次，每次5 min，封片觀察。

1.6細(xì)胞活性的檢測

在96孔板中每個(gè)孔內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液，接種密度為5×104個(gè)；實(shí)驗(yàn)分組：單純殼聚糖組(4 mg/ ml)、單純bFGF組(25 ng/ml)、bFGF-殼聚糖組(4 mg/ ml)和單純培養(yǎng)基組。每組6個(gè)重復(fù)樣本，細(xì)胞每3天半量換液1次。細(xì)胞在誘導(dǎo)1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d后，每孔加入0.1 mmol/L MTT 10 μl，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸去上清，每孔內(nèi)加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μl，振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm檢測吸光值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Levene's test確定數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，然后采用單因素方差分析進(jìn)行總體差異的分析，采用Bonferroni分析法進(jìn)行兩兩組間的比較。顯著性水平α=0.05。

2結(jié)果

2.1 rMSCs鑒定

大多數(shù)細(xì)胞呈扁平形、梭形、三角形，為典型的rMSC的形狀(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，平均91%的細(xì)胞為CD44+/CD45-；平均97%細(xì)胞是CD45-/ CD90+，這說明從成年大鼠股骨和脛骨的髓腔內(nèi)提取的細(xì)胞，經(jīng)過3～6次傳代培養(yǎng)后，90%以上的細(xì)胞為rMSCs。見圖2、圖3。

圖1 rMSCs傳代3代后的形態(tài)(相差顯微鏡20×10×1.6)

2.2光鏡下結(jié)果

在特定的時(shí)間點(diǎn)，我們觀察rMSCs在無血清條件下，在3組培養(yǎng)體系中的行為變化。

單純bFGF組：培養(yǎng)1 d后，沒有觀察到球狀細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，球狀細(xì)胞極少。

單純殼聚糖組：培養(yǎng)前3 d內(nèi)，有小的細(xì)胞球產(chǎn)生，培養(yǎng)1周后，球狀細(xì)胞數(shù)目增加并且伸出細(xì)而短的突起。

bFGF-殼聚糖組：培養(yǎng)1 d后，球狀細(xì)胞產(chǎn)生，1周后，球狀細(xì)胞數(shù)目顯著增加，且大量的細(xì)而短的突起產(chǎn)生。見圖4。

圖2 rMSCs傳3代后表面標(biāo)記(CD45、CD44雙標(biāo))鑒定

2.3免疫熒光染色

3 d時(shí)對(duì)單純bFGF組、單純殼聚糖組和bFGF-殼聚糖組進(jìn)行免疫組化染色，3組中未成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物β-tubulinⅢ和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物nestin均表達(dá)，單純bFGF組中nestin和β-tubulinⅢ表達(dá)量高于其他兩組。見圖5。星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP在單純bFGF組和bFGF-殼聚糖組中表達(dá)，在單純殼聚糖組中極少。見圖6。

7 d時(shí)，3組中β-tubulinⅢ和nestin均表達(dá)；bFGF-殼聚糖組中nestin和β-tubulinⅢ表達(dá)量高于其他兩組，GFAP在3組中極少。見圖7。9 d時(shí)，bFGF-殼聚糖組中nestin和β-tubulinⅢ持續(xù)高表達(dá)。見圖8。

圖5～圖9表明rMSCs誘導(dǎo)初期可以產(chǎn)生未成熟神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，未成熟細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞在bFGF-殼聚糖組中持續(xù)高表達(dá)。

2.4細(xì)胞活性的檢測

4組細(xì)胞在誘導(dǎo)1 d后，細(xì)胞活性無顯著性差異(P＞0.05)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，3 d、7 d、14 d、21 d后，bFGF-殼聚糖載體組細(xì)胞活性明顯高于單純殼聚糖組、單純bFGF組和對(duì)照組(P＜0.05)；誘導(dǎo)3 d、7 d后，單純bFGF組細(xì)胞活性明顯高于單純殼聚糖組和對(duì)照組(P＜0.05)。誘導(dǎo)28 d后4組細(xì)胞的細(xì)胞活性無顯著性差異(P＞0.05)。整個(gè)誘導(dǎo)過程中單純殼聚糖組和對(duì)照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖10。

圖3 rMSCs傳3代后表面標(biāo)記(CD45、CD90雙標(biāo))鑒定

圖4 rMSCs各組誘導(dǎo)7 d后的狀態(tài)(相差顯微鏡，40×10×1.6)

圖5 各組誘導(dǎo)3 d免疫熒光染色(熒光顯微鏡，20×10×1.6 紅色：nestin；綠色：β-tubulinⅢ)

圖6 bFGF-殼聚糖組3 d免疫熒光染色(熒光顯微鏡)

圖7 各組誘導(dǎo)7 d免疫熒光染色(熒光顯微鏡，紅色：nestin；綠色：β-tubulinⅢ)

圖8 bFGF-殼聚糖組9 d免疫熒光染色(熒光顯微鏡)

圖9 bFGF-殼聚糖組不同時(shí)間nestin陽性細(xì)胞百分率

圖10 rMSCs在誘導(dǎo)不同時(shí)間后各組細(xì)胞的活性

3討論

rMSCs是一類存在于骨髓基質(zhì)中的成體干細(xì)胞，參與骨髓微環(huán)境的形成，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞分化的潛能。由于rMSCs缺乏特異性表面抗原標(biāo)志分子，因此通常以細(xì)胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105等陽性標(biāo)志，以及CD34、CD45等陰性標(biāo)志作為鑒別指標(biāo)[8-9]。自體MSCs的數(shù)量和功能受年齡、疾病等因素的影響，體外擴(kuò)增時(shí)間長。rMSCs具有多向分化潛能，低免疫原性，同種異體移植后能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，因此逐漸成為再生醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)[10-12]。

目前，測定細(xì)胞活性、檢測生物材料的生物相容性和細(xì)胞毒性常用的一種實(shí)驗(yàn)方法是MTT比色法[13]。將殼聚糖和rMSCs共培養(yǎng)，可研究殼聚糖載體是否對(duì)干細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)作用。結(jié)合乳鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單純殼聚糖對(duì)不同來源的干細(xì)胞均無細(xì)胞毒性,也不會(huì)抑制它們的分化，具有很好的生物相容性。

比較bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)7 d乳鼠的rMSCs分化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種來源的rMSCs均可向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，且誘導(dǎo)比例均要明顯高于單純bFGF組和單純殼聚糖組[7]。同時(shí)，在誘導(dǎo)過程中，成年的rMSCs可轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，bFGF-殼聚糖載體組神經(jīng)干細(xì)胞的比例可高達(dá)49.4%，明顯高于單純bFGF組和單純殼聚糖組。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，神經(jīng)元為存在的主要細(xì)胞類型，其起來源可有兩種途徑，一種由rMSCs直接分化為神經(jīng)元，另一種由rMSCs先轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞再分化為神經(jīng)元。

移植NSC為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等治療提供了一個(gè)頗具前景的新途徑，但獲得NSCs受到取材困難及倫理學(xué)等方面的限制，目前的研究多集中在紋狀體和皮層的NSC上，很難廣泛應(yīng)用于臨床[14]。而本實(shí)驗(yàn)中成年rMSCs轉(zhuǎn)化為NSC，而不是使用幼年的rMSCs，其應(yīng)用更為廣泛，為NSC移植提供新的種子來源，這樣將能克服從腦組織獲取NSCs的危險(xiǎn)性和局限性，同時(shí)又可避免胎兒腦組織移植存在的倫理和免疫排斥問題，有可能解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病的臨床個(gè)體化治療問題，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

之前研究證明25 ng/ml的bFGF是體外NSC生長的最適宜的濃度[15]。因此，在我們的研究中，每10 mg的殼聚糖載體結(jié)合bFGF 10 ng，制成bFGF-殼聚糖載體，每1 ml培養(yǎng)基中一次性加入殼聚糖載體10 mg，用來觀察殼聚糖載體結(jié)合的bFGF的作用效果。前期研究證明神經(jīng)營養(yǎng)因子與生物材料基質(zhì)結(jié)合后，既可以提高神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用效率，同時(shí)也可以延長神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用時(shí)間[16]。

調(diào)研bFGF能誘導(dǎo)MSCs的神經(jīng)分化發(fā)現(xiàn)，利用DNA測序方法檢出MSCs表面存在FGF受體[17]。FGF作用于MSCs時(shí),可以與MSCs的表面受體結(jié)合，進(jìn)一步激活一系列的胞內(nèi)反應(yīng)，促使rMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。激活的bFGF受體，將信號(hào)傳到胞內(nèi)，通過Ras/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，完成細(xì)胞外信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞而發(fā)揮其生物學(xué)活性作用[18]。然而，具體的轉(zhuǎn)化機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證明。

本實(shí)驗(yàn)bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為NSC提供依據(jù)。接下來需闡明bFGF-殼聚糖載體作用下的MSCs向NSC的轉(zhuǎn)化過程的機(jī)制。

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Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells'Transformation into Nerve Cells Induced by Basic Fibroblast Growth Factor-Chitosan Carrier

TU Xiao-meng,DUAN Hong-mei,RAO Jia-sheng,et al.School of Biological and Medical Engineering,Beijing Institute of Technology,Beijing 100191,China

ObjectiveTo explore the induction of basic fibroblast growth factor(bFGF)-chitosan carrier transforming the adult rat bone marrow mesenchymal stem cells(rMSCs)into nerve cells.MethodsrMSCs were detected qualitatively and counted quantitatively by immunohistochemistry after they were induced into nerve cells,such as neural stem cells neurons and astrocytes.The methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)chromometry assay was carried out to determine the cell viability.ResultsrMSCs induced by bFGF-chitosan carrier expressed neural stem cell marker nestin,neuron marker β-tubulinⅢand astrocytes marker glial fibrillary acidic protein(GFAP).Nestin expressed more in the bFGF-chitosan group,and reached its maximum(49.40%)at the 9th day.ConclusionbFGF-chitosan carrier can induce the adult rMSCs differentiate into neural stem cells in a high proportion.

bone marrow mesenchymal stem cell;basic fibroblast growth factor;chitosan;nerve transformation;neural stem cells;neurons;astrocytes;rats

R329.2

A

1006-9771(2013)10-0916-06

2012-10-22

2013-08-22)

1.北京市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(No.D09080104660000)；2.國家自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.31130022)；3.國家科技支撐計(jì)劃(No. 2012BAI17B04)；4.國家“863”計(jì)劃(No.2012AA020506)。

1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京市100069。作者簡介：涂曉萌(1987-)，女，河南項(xiàng)城市人，碩士研究生，主要研究方向：應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。通訊作者：李曉光(1959-)，男，漢族，吉林長春市人，博士，教授，主要研究方向：應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.10.005