劉秉揚，聶英斌

（1.三明學院機電工程學院，福建三明365004；2.福建師范大學醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建福州350007）

時間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織

劉秉揚1，聶英斌2

（1.三明學院機電工程學院，福建三明365004；2.福建師范大學醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建福州350007）

實驗測量了在405 nm的脈沖激光激發(fā)下，人體離體正常和癌變結(jié)腸組織在635 nm熒光發(fā)射峰的時間分辨自體熒光光譜特性。采用雙指數(shù)衰減方程對時間分辨自體熒光光譜進行擬合，得到相應的平均熒光壽命。結(jié)果顯示：人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27±3.31）ns，二者存在顯著差異。采用時間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織的靈敏度和特異性分別為100％和93％。初步表明時間分辨自體熒光光譜有望用于診斷早期結(jié)腸癌。

時間分辨自體熒光光譜；熒光壽命，結(jié)腸組織；組織診斷

隨著激光技術的發(fā)展，采用激光誘導熒光技術對腫瘤進行早期診斷已經(jīng)成為當前臨床診斷醫(yī)學領域的一個重要課題，備受國內(nèi)外許多研究小組的關注［1－3］。與傳統(tǒng)的病理檢查相比，激光誘導熒光技術具有安全、無損、快速和實時在體檢測等優(yōu)點［4］。激光誘導熒光發(fā)射包括穩(wěn)態(tài)光譜（頻域）特性和時間分辨（時域）特性兩個方面。穩(wěn)態(tài)熒光光譜主要測量在特定激發(fā)波長條件下的熒光發(fā)射光譜，通過比較熒光發(fā)射峰位置和強度等方面的信息來判別正常與病變組織。但是穩(wěn)態(tài)熒光光譜受到生物組織體內(nèi)環(huán)境和光學系統(tǒng)等因素的影響，無法全面表達生物組織的內(nèi)源性熒光物質(zhì)所處的微環(huán)境的物理和化學性質(zhì)。時間分辨自體熒光光譜技術不受到上述條件的限制，可以從時間弛豫和動力學角度對熒光物質(zhì)成分進行全面深入的研究，達到全面表征生物組織內(nèi)源性物質(zhì)生化特性的目的［5］。

當前國內(nèi)外許多研究小組主要致力于穩(wěn)態(tài)自體熒光光譜診斷早期腫瘤的研究，而利用時間分辨自體熒光光譜診斷早期結(jié)腸癌方面卻鮮見報道。結(jié)腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率僅次于胃癌和食道癌位居胃腸道腫瘤的第三位［6］。傳統(tǒng)的臨床手術活檢方法在診斷早期結(jié)腸癌中具有很大的主觀隨機性，不一定能準確、全面地對病灶位置定性，且活檢所需時間長、步驟多，不能實現(xiàn)在體的實時診斷［7-9］。因此，臨床上亟待尋找一種能正確指導或替代活檢的準確、快捷的診斷方法。實驗研究了人體離體結(jié)腸組織的時間分辨自體熒光光譜，結(jié)果表明：人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27± 3.31）ns，兩者之間存在顯著差異。采用時間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織的靈敏度和特異性分別為100％和93％。

1 材料與方法

1.1 組織樣品

實驗樣品取自福建省立醫(yī)院普通外科腸癌切除手術，每組樣品均包含實驗組（癌變）和對照組（正常）。每個樣品均分為兩份，其中一份送臨床病理分析，另外一份采用生理鹽水進行清洗，離體2 h之內(nèi)完成時間分辨自體熒光光譜測量。

1.2 實驗儀器

實驗采用FLS920（Edinburgh Analytical Instruments，UK）熒光光譜探測系統(tǒng)，該系統(tǒng)的狹縫大小可以根據(jù)所檢測熒光信號的強弱進行連續(xù)調(diào)節(jié)，同組實驗條件保持一致。選取脈沖寬度為90 ps的二極管激光器（405 nm，350 mW，Edinburgh Instruments Ltd，UK）作為激發(fā)光源。

2 結(jié)果與討論

人體離體正常和癌變結(jié)腸組織在405 nm激發(fā)下的歸一化自體熒光發(fā)射光譜如圖1所示，由圖可知，人體正常和癌變結(jié)腸組織均在520和620 nm處存在發(fā)射峰。與正常組織不同的是，癌變組織在620 nm處的峰位發(fā)生約15 nm的紅移，并且在690 nm處還存在一個特征峰。根據(jù)文獻報道520 nm處的熒光發(fā)射峰是由人體內(nèi)源性熒光物質(zhì)FAD產(chǎn)生，而635 nm和690 nm的熒光則是內(nèi)源性卟啉特異性產(chǎn)生［10-11］。從穩(wěn)態(tài)熒光光譜可知，人體癌變結(jié)腸組織中的內(nèi)源性卟啉相對含量顯著高于正常組織。為了深入分析兩種內(nèi)源性熒光物質(zhì)組分的相對含量差異，文章進一步測量了兩種組織體的時間分辨自體熒光光譜。

實驗測量了14組人體正常組織與癌變結(jié)腸組織離體樣品在405 nm激發(fā)下，635 nm處的時間分辨自體熒光光譜。人體離體正常和癌變結(jié)腸組織的時間分辨熒光光譜如圖2所示，對所獲得的時間分辨熒光光譜數(shù)據(jù)采用擬合公式(1)進行雙指數(shù)擬合，擬合優(yōu)度R2均接近1。式中A1和A2是指前因子，代表了每種內(nèi)源性熒光物質(zhì)對總的熒光信號的貢獻；τ1和τ2分別代表各單一組分的熒光物質(zhì)的熒光壽命。通過擬合實驗所得的熒光衰減曲線，就可以計算出揭示熒光衰減本質(zhì)的平均熒光壽命。

圖1 人體正常和癌變結(jié)腸組織在405 nm波長激發(fā)下的歸一化熒光發(fā)射光譜

考慮不同組織樣品的組織體差異性，進一步計算正常和癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命，采用公式(2)計算得到的人體正常與癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命如表1所示，人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27±3.31）ns，兩者之間存在顯著差異（P＜0.001）。

圖2 人體正常和癌變結(jié)腸組織的時間分辨自體熒光光譜

表1 人體正常與癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命

結(jié)果顯示，不管是正常還是癌變結(jié)腸組織，熒光壽命較短的內(nèi)源性熒光物質(zhì)的比例都比長壽命內(nèi)源性熒光物質(zhì)比例高，在正常組織和癌變組織中兩種組分的相對比例分別約為（3∶1）和（2.3∶1），說明這兩種內(nèi)源性熒光成分在不同組織類型內(nèi)的含量存在差異。DaCosta等人［12］的研究表明內(nèi)源性卟啉的熒光壽命為（14.94±0.06）ns，這與文章測量得到人體癌變結(jié)腸組織405～635 nm處的熒光壽命為（13.27±3.31）ns吻合，說明人體癌變結(jié)腸組織中的內(nèi)源性卟啉含量顯著高于正常組織。

實驗統(tǒng)計結(jié)果表明人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27± 3.31）ns，其平均熒光壽命及其標準偏差如圖3所示，兩者存在顯著性差異。選取人體正常和癌變結(jié)腸組織在635 nm處自體熒光的平均壽命區(qū)分閾值τ=7.0 ns，結(jié)合臨床病理診斷結(jié)果，分析得到采用時間分辨自體熒光診斷的靈敏度和特異性分別為100％和93％。

圖3 人體正常和癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命及其標準偏差

3 結(jié)論

人體結(jié)腸組織自體熒光的發(fā)光機理和組織體內(nèi)源性熒光物質(zhì)密切有關，不同組織中，由于內(nèi)源性熒光物質(zhì)的相對含量以及微環(huán)境不同，生理狀態(tài)和細胞代謝的不同，導致其時間分辨熒光光譜存在差異。本文采用時間分辨自體熒光光譜進行人體結(jié)腸組織診斷的可行性研究。實驗結(jié)果顯示：人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87± 0.75）ns和（13.27±3.31）ns，兩者之間存在顯著差異。采用時間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織的靈敏度和特異性分別為100％和93％。實驗結(jié)果說明采用時間分辨自體熒光光譜有望作為診斷早期結(jié)腸癌的一種有效手段。

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Time-resolved Autofluorescence Spectroscopy for Classification of Human Normal and Abnormal Colonic Tissues

LIU Bing-yang1，NIE Ying-bin2
（1.College of Electromechanical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 2.Key Laboratory of Optoelectronics Science and Technology for Medicine of Ministry of Education, Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China）

Time-resolved autofluorescence spectroscopies at 635 nm under 405 nm excitation were measured for human normal and abnormal colonic tissues in vitro.The main fluorescence lifetime of the tissues were calculated by the two-component lifetime fitting of time-resolved autofluorescence spectroscopies.The results showed that the average lifetime of normal and abnormal human colonic tissues are about(4.87±0.75)ns and(13.27±3.31)ns,respectively.In this method, the sensitivity and specificity for diagnosis of human colonic carcinoma tissue are 100％and 93％.Experimental results indicated that the time-resolved autofluorescence spectroscopies can be potentially used to distinguish early human colonic carcinoma tissue.

time-resolved autofluorescence spectroscopies;fluorescence lifetime;human colonic tissues;tissue diagnosis

R318.51

A

1673-4343（2013）02-0049-04

2012-12-15

三明學院自然科學基金項目（B201009/Q）

劉秉揚，男，福建莆田人，講師。研究方向:生物醫(yī)學光學。