袁 汀，康美男

清熱合劑由黃芩、大青葉、貫眾、葛根、茵陳5味中藥制成，具有清熱解毒的功效，臨床用于治療病毒性上呼吸道感染引起的流感、腮腺炎等疾病的治療［1-2］。清熱合劑方中，黃芩為君藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。葛根為方中臣藥，具有解表退熱、生津止渴、止瀉的功能，并能改善高血壓患者的頸強、頭暈、頭痛、耳鳴等癥狀。大青葉具有清熱、解毒、涼血、止血之功效，治療溫病熱盛煩渴、流行性感冒、急性傳染性肝炎、菌痢、癰疽腫毒等癥;貫眾殺蛔蟲、絳蟲、蟯蟲，清熱、解毒、涼血、止血，治療風(fēng)熱感冒;茵陳清熱利濕、退黃，主治黃疸、小便不利、濕瘡瘙癢、傳染性黃疸型肝炎等癥。三藥共為佐藥，佐助黃芩、葛根共奏清熱除瘟之功。黃芩中含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等多種黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證明，黃芩苷具有抗病毒［3-4］、抗炎［5］、抑菌［6-9］等功效，為清熱合劑中主要藥效成分，黃芩苷含量高低直接影響清熱合劑對其適應(yīng)病癥的治療效果。近年來對中藥復(fù)方制劑中黃芩苷含量受配伍影響的相關(guān)研究較多，實驗結(jié)果已經(jīng)證明，不同配伍能使多種復(fù)方中黃芩苷含量發(fā)生變化［10-13］。為明確清熱合劑中各組方藥材間配伍規(guī)律，有效控制該制劑質(zhì)量，本文選取黃芩苷作為考察指標，依據(jù)正交試驗設(shè)計原則，對比研究清熱合劑7種不同配伍組成中黃芩苷的含量變化，以評價清熱合劑中不同配伍組成對制劑中有效化學(xué)成分含量的影響。

1 材料

1.1 儀器 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);AS3210型超聲波清洗器(沈陽天美);E-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TG328A電光分析天平(上海天平儀器廠);自動雙重純水蒸餾器(型號SZ-93，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，110715-201016);中藥材為市售并經(jīng)我院副主任中藥師鑒定;清熱合劑(我院自制，批號:20120315、20120316、20120317);甲醇為色譜純，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用Aglilent-Zorbax-Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫30℃;流動相為0.4%磷酸 －甲醇(55∶45);流速 1.0 mL/min;檢測波長 280 nm;進樣量20 μL。在上述色譜條件下，按黃芩苷計算，理論塔板數(shù)均不低于3 000，與相鄰峰之間分離度均大于1.5，結(jié)果見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品25 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的對照品儲備液。精密量取儲備液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，制成0.1 mg/mL的對照品溶液。

圖1 黃芩苷對照品(A)、清熱合劑樣品(B)、清熱合劑陰性樣品(C)的HPLC色譜圖注:1.黃芩苷

2.2.2 供試品溶液的制備 按照清熱合劑制備工藝將處方組成中的黃芩、大青葉、貫眾、葛根、茵陳5味藥材以適宜方法進行提取，合并提取液，除去其中雜質(zhì)，濃縮至所需比重范圍內(nèi)，即得清熱合劑樣品。精密量取清熱合劑樣品1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇約40 mL超聲處理20 min，放冷，定容，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 除去黃芩以外的其他組方藥材，按工藝制成清熱合劑陰性樣品，按照“2.2.2”中供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 標準曲線的繪制 分別精密吸取“2.2.1”項下的黃芩苷對照品儲備液 0.5、1、2、4、8 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20 μL，以黃芩苷進樣量為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為y=72 348x-1 727.6(r=0.999 7)，黃芩苷在0.001～0.016 mg的范圍內(nèi)含量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μL，重復(fù)進樣6次，測得黃芩苷的峰面積的RSD為0.93%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗 精密量取同一批樣品6份，按“2.2.2”項下方法平行制備成供試品溶液，分別進樣20 μL進行測定，計算黃芩苷含量，其RSD為0.82%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別在 0、1、2、3、4 h進樣 20 μL，測定黃芩苷的含量，RSD為0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗 精密量取黃芩苷含量為0.065 93 mg/mL的清熱合劑1 mL，分別精密加入黃芩苷對照品液0.7 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，計算回收率，結(jié)果黃芩苷的平均回收率為99.2%，RSD為0.9%(n=6)，見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=6)

3 正交試驗考察不同配伍條件對黃芩苷含量的影響

3.1 正交設(shè)計 固定黃芩，以大青葉、貫眾、葛根、茵陳為考察因素，各因素設(shè)“有”、“無”兩水平，并考慮兩兩交互作用，因素水平表見表2。

3.2 供試品溶液的制備 按清熱合劑制備工藝制備不同配伍組成的樣品，按“2.2.2”項下方法制成對應(yīng)樣品溶液。

3.3 樣品含量測定 按上述色譜條件進樣測定各配伍組成樣品的黃芩苷含量，結(jié)果見表3、表4。由實驗數(shù)據(jù)可知，各因素對清熱合劑中黃芩苷含量的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。直觀分析各因素對檢測指標的影響大小順序為茵陳＞葛根＞貫眾＞大青葉。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析表

4 討論

正交試驗是多因素多水平研究的一種設(shè)計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點。正交試驗設(shè)計是分式析因設(shè)計的主要方法，是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法。為了加強對清熱合劑的處方循證研究，根據(jù)文獻建立了黃芩苷含量的HPLC測定方法［11］，選擇方劑中主藥黃芩中黃芩苷為不變量，其他為因變量，研究有效成分黃芩苷在不同配伍組成條件下的變化。

本實驗采用L8(27)正交設(shè)計法及正交助手軟件對清熱合劑中的黃芩苷含量進行分析，結(jié)果顯示，大青葉與貫眾對黃芩苷的含量影響不大，茵陳與葛根的加入則明顯降低了黃芩苷的含量;大青葉與茵陳，貫眾與葛根，貫眾與茵陳的交互效應(yīng)使黃芩苷的含量降低;大青葉與葛根、葛根與茵陳、大青葉與貫眾的交互效應(yīng)對黃芩苷含量影響不明顯。

從實驗結(jié)果可見，中藥的配伍不是藥物之間的簡單加合，中藥的不同配伍組成對處方中有效成分的含量是有一定影響的。在中藥制劑過程中必然會發(fā)生一系列物理、化學(xué)反應(yīng)，一部分可能是單純的化學(xué)成分含量增減變化，同時在一定的溶劑中，在溫度影響以及某些物質(zhì)的催化作用之下，也可能生成新的化學(xué)物質(zhì)。因此，考察制劑配伍規(guī)律，除考察特定化學(xué)成分的含量變化之外，還應(yīng)結(jié)合制劑的整體成分變化及藥效作用進行全面分析，這項研究還有待于今后進一步開展。

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