李冬梅，張淑珍，車 薇，張紅果

腫瘤一直是危害人類生命的頑疾之一，合理配伍生物調(diào)節(jié)劑、增效減毒是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域一個(gè)積極的探索方向，特別是中藥提取物與化療藥聯(lián)合應(yīng)用，能夠提高抗腫瘤的療效。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)為非黃酮類的多酚化合物，廣泛分布于多種植物中。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Res具有多種生物活性，其抗腫瘤作用引起廣泛關(guān)注，是最具有希望的天然腫瘤預(yù)防劑之一［1-2］。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是腫瘤治療常用的化療藥物，但其毒副作用較大，可造成機(jī)體免疫功能低下［3］，限制了其臨床應(yīng)用。本研究通過觀察Res合用5-Fu的抗腫瘤活性，證實(shí)二者對(duì)腫瘤的聯(lián)合治療作用，以期為臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(冀)2008-1-003。瘤源:荷 S180肉瘤(腹水型)小鼠，為接種腫瘤細(xì)胞7 d后生長良好的荷瘤動(dòng)物，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心傳代保存。

1.2 藥品和試劑 Res(純度≥98%)、5-Fu(純度≥99%)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、刀豆蛋白 A(ConA)、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液，密度:1.077 g/mL，Axia-Shield公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基加入胎牛血清配成濃度10%的完全培養(yǎng)液;MTT用DMEM培養(yǎng)液配成0.5%的溶液，微孔濾膜除菌。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，TS100-F-PH型倒置熒光相差顯微鏡，AC100-110型酶標(biāo)儀。

1.4 方法

1.4.1 藥物的配制 體外試驗(yàn):將Res和5-Fu分別用DMSO溶解，微孔濾膜除菌，以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。體內(nèi)試驗(yàn):將Res和5-Fu分別用DMSO溶解，均以生理鹽水稀釋成所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2 Res合用5-Fu對(duì)體外脾細(xì)胞增殖的影響

按MTT法進(jìn)行。取正常小鼠，脫頸椎處死，無菌制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)液洗滌、懸浮沉淀，沿管壁緩緩加至淋巴細(xì)胞分離液上，離心，取液體中間層呈云霧狀的淋巴細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌，以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液懸浮沉淀，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。加入完全培養(yǎng)液至細(xì)胞含量為107/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)12 h后，分別加入50 μL 系列濃度的藥物，藥物組分為 Res組(0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)、5-Fu 組 (0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)、Res+5-Fu 組。再加入 50 μL ConA(終質(zhì)量濃度 10 μg/mL)，空白組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)，于68 h取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5 min，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)OD值。

1.4.3 Res合用5-Fu對(duì)S180抑瘤活性的影響將荷瘤小鼠(瘤株)脫頸椎處死，于無菌條件下吸取腹水，按照腹水∶生理鹽水=1∶4的比例進(jìn)行稀釋，將稀釋后的腹水按每只0.2 mL(腫瘤細(xì)胞數(shù)約5×109/L)接種于動(dòng)物右側(cè)腋窩皮下。接種后24 h，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組:模型組(等量生理鹽水)、Res組(20 mg/kg)、5-Fu 組(20 mg/kg)、Res合用5-Fu組(Res 20 mg/kg+5-Fu 20 mg/kg)，每組10只。各組均腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)10 d，每天觀察小鼠的活動(dòng)情況。末次給藥24 h后，各組動(dòng)物稱重，脫頸椎處死，取瘤體稱重并比較各組差異，計(jì)算抑瘤率:抑瘤率(%)=［(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重］×100%;另取胸腺和脾臟稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Res合用5-Fu對(duì)體外脾細(xì)胞增殖的影響Res單用劑量≥0.1 μg/mL，5-Fu單用劑量≥0.1 μg/mL，以及二者合用時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性(P＜0.05或P＜0.01)，且抑制作用隨藥物濃度的增加而提高。結(jié)果見表1。

表1 Res合用5-Fu對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖的影響(n=3)

2.2 Res合用5-Fu對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

各藥物組荷瘤小鼠的體質(zhì)量增長均較模型組低，其中Res合用5-Fu組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各藥物組瘤重與模型組相比均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，Res合用5-Fu組與單用組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Res合用5-Fu的抑瘤率達(dá)到41%，明顯大于單用Res或5-Fu。結(jié)果見表2。

表2 Res合用5-Fu對(duì)S180荷瘤小鼠體質(zhì)量及瘤重的影響

2.3 Res合用5-Fu對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官的影響 單用Res對(duì)免疫器官指數(shù)影響不顯著，單用5-Fu可導(dǎo)致免疫器官腎臟和胸腺出現(xiàn)不同程度的萎縮(P＜0.05或P＜0.01)。Res合用5-Fu可提高脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與5-Fu組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果見表3。

表3 Res合用5-Fu對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官的影響

3 討論

由于放化療不良反應(yīng)嚴(yán)重，尋找以增效減毒為目標(biāo)的多元化腫瘤治療方案是目前抗腫瘤領(lǐng)域的重要研究課題之一。目前，國內(nèi)外已對(duì)Res預(yù)防和抑制腫瘤的作用進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)Res對(duì)乳腺癌、胃癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、大腸癌等都有較好的抑制作用［4-5］;對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性作用，可在不同階段通過抑制腫瘤始發(fā)的突變、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等方面起作用［1，6］。5-Fu是臨床上治療腫瘤的常規(guī)化療藥物，但該藥在殺傷瘤細(xì)胞的同時(shí)，也導(dǎo)致腫瘤患者免疫低下［7-8］，而免疫功能低下又可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究探討了二者聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤作用。

本研究通過觀察Res合用5-Fu對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，Res合用5-Fu對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，且其作用隨濃度增加而增強(qiáng);陳素梅等［9］研究認(rèn)為，Res與化療藥聯(lián)合應(yīng)用，可明顯加強(qiáng)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的抑制，比單用抑制作用更強(qiáng)。本研究通過觀察Res合用5-Fu對(duì)小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用，結(jié)果表明，Res合用5-Fu能明顯抑制荷瘤小鼠的實(shí)體瘤重，抑瘤率高于單用Res或5-Fu，說明二者聯(lián)合使用有一定的協(xié)同作用。這與孫中杰等［10］的研究結(jié)果相似，其研究認(rèn)為，Res在體內(nèi)具有抑制小鼠肝癌H22的作用，與5-Fu聯(lián)合具有協(xié)同作用，能夠增強(qiáng)5-Fu抑制小鼠肝癌H22的作用。改善免疫功能低下也有利于腫瘤治療。本研究發(fā)現(xiàn)，Res合用5-Fu對(duì)5-Fu所致的免疫器官萎縮有保護(hù)作用，提示二者配伍增強(qiáng)了荷瘤小鼠對(duì)腫瘤和外界刺激的反應(yīng)能力。這與劉紅山等［11］認(rèn)為，Res對(duì)5-Fu所致小鼠白細(xì)胞減少、免疫器官萎縮等毒副反應(yīng)具有保護(hù)作用的研究結(jié)果一致。

綜上所述，Res與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用具有較好的抑瘤效果，并能影響動(dòng)物的免疫功能，說明二者合用抗腫瘤有協(xié)同作用。

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