徐海波,王 可,杜蕓輝,白克華,張?zhí)K麗,李 笑,劉 騰,馬新亮*,劉慧榮,3*

（首都醫(yī)科大學(xué)生理與病理生理學(xué)教研室,北京 100069; 2山東大學(xué)海洋學(xué)院海洋生物工程教研室,威海 264209; 3山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室,太原 030001）

衰老是機(jī)體隨年齡改變而發(fā)生的所有現(xiàn)象的集中體現(xiàn)。在衰老過(guò)程中，機(jī)體各組織器官的功能逐漸降低，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。因此，可以把衰老定義為機(jī)體對(duì)內(nèi)、外環(huán)境改變的、年齡依賴性的易損性增加，而心臟的衰老本身可明顯增加心臟疾病發(fā)生的危險(xiǎn)，但病因還不清楚。研究表明，生理情況下，心臟存在低水平的自噬，用于維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能[1]；隨著年齡的增長(zhǎng)，心肌細(xì)胞內(nèi)自噬功能逐漸降低[2,3]。而在一定程度上誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬，則可以明顯改善衰老心臟功能，降低心臟衰老標(biāo)志物的生成，如β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）[4]。此外，LC3-Ⅱ是檢測(cè)哺乳動(dòng)物自噬體激活公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)記物[5,6]，而B(niǎo)eclin1是介導(dǎo)自噬的特異性基因，在自噬發(fā)生時(shí)起正調(diào)控作用，是調(diào)控自噬的一個(gè)關(guān)鍵因子[7]。已知Omi是大腸埃希氏桿菌熱休克誘導(dǎo)蛋白HtrA的人類同源物，又稱Omi/HtrA2，屬于絲氨酸蛋白水解酶家族[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠心肌組織中Omi/HtrA2蛋白水平增加[9]，自噬水平下降[10]，然而這一現(xiàn)象不足以證實(shí)在衰老大鼠心肌組織中表達(dá)增加的Omi/HtrA2與心肌細(xì)胞自噬下降的因果關(guān)系。因此，本研究通過(guò)建立H9c2心肌細(xì)胞衰老模型，分別下調(diào)和上調(diào)H9c2細(xì)胞中Omi/HtrA2的水平，觀察心肌細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而明確衰老心肌中增加的Omi/HtrA2與心肌細(xì)胞自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

H9c2(2-1)大鼠胚胎心肌細(xì)胞系，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒（lactic dehydrogenase，LDH，瑞士Roche公司）；0.05%胰酶-EDTA（美國(guó)Invitrogen公司）；D-半乳糖（D-galactose，D-gal，Sigma公司）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒（β-galactosidase Assay Kit，Cell Signaling公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8，日本同仁化學(xué)公司）；絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2一抗（High Temperature Requirement，Cell Signaling公司）；Omi/HtrA2的特異性抑制劑ucf-101（Merck公司）；beta-actin一抗（β-actin，美國(guó)Santa Cruz公司)；beclin1一抗（Cell Signaling公司）；LC3-Ⅱ一抗（Cell Signaling公司）；山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記、辣根酶標(biāo)記鏈親合素（北京中杉金橋公司）；ChemiScope Mini系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇各藥物相應(yīng)劑量和時(shí)間，將H9c2心肌細(xì)胞消化后得到的單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至（5×105～6×105個(gè)/ml后，接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分組：（1）H9c2心肌細(xì)胞對(duì)照組；（2）D-半乳糖干預(yù)衰老組：D-半乳糖（8g/L）誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞衰老組；（3）ucf-101組：10-5mol/L ucf-101作用組[11]；（4）H9c2心肌細(xì)胞Omi/HtrA2過(guò)表達(dá)組：利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染使H9c2細(xì)胞過(guò)表達(dá)Omi/HtrA2；H9c2誘導(dǎo)衰老實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間為5d，其余指標(biāo)為72h，各處理組n值均為6。

1.2.2 β-半乳糖苷酶染色 β-半乳糖苷酶染色參考試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，光學(xué)顯微鏡下觀察H9c2細(xì)胞的染色情況，并計(jì)算β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

1.2.3 cck-8法檢測(cè)H9c2存活率 將H9c2細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，待生長(zhǎng)至單層融合后，加用不同藥物處理72h。更換新鮮的培養(yǎng)基后，每孔加入cck-8試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率＝處理組細(xì)胞OD值/正常對(duì)照組細(xì)胞OD值×100%。

1.2.4 LDH活性測(cè)定 將H9c2細(xì)胞以每孔3×104個(gè)接種于24孔培養(yǎng)板，待生長(zhǎng)至80%～90%融合后，加用不同藥物處理72h。吸取上清液，參照Korzeniewski等[12]的方法，用分光光度儀測(cè)定各孔OD值，計(jì)算LDH活性。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Omi/HtrA2、beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá) 將H9c2細(xì)胞以每孔105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，待生長(zhǎng)至80%～90%融合后，加用不同藥物處理72h。加入細(xì)胞裂解液冰上裂解15min，12000r/min離心10min，收集細(xì)胞裂解物，BCA法蛋白定量。取各組樣品蛋白100μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h；用含Tween-20的Tris緩沖鹽溶液（TBST）洗膜10min×3次；分別加以下一抗：Omi/HtrA2（1∶1000稀釋）、beclin1（1∶1000稀釋）、LC3-Ⅱ（1∶1000稀釋）、β-actin（1∶1000稀釋）4℃過(guò)夜；TBST洗膜10min×3次，再與生物素標(biāo)記的二抗孵育1h，TBST洗膜10min×3次，與辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育1h，TBST洗膜10min×3次，ChemiScope發(fā)光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組之間采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建立衰老H9c2心肌細(xì)胞模型

2.1.1 H9c2心肌細(xì)胞衰老模型鑒定 各組細(xì)胞分別進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色，結(jié)果顯示：與H9c2心肌細(xì)胞對(duì)照組比較，D-半乳糖干預(yù)衰老組β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率顯著升高[（87.7%±3.6%）vs（18.3%±2.8%），P＜0.01; 圖1]。

2.1.2 D-半乳糖對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率和LDH活性的影響 cck8和LDH檢測(cè)結(jié)果顯示：與H9c2心肌細(xì)胞對(duì)照組比較，D-半乳糖干預(yù)衰老組細(xì)胞存活率略有上升，與H9c2心肌細(xì)胞對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（116.58%±12.95%）vs（100.00%±6.81%）；P＞0.05]，但LDH活性則顯著升高[（7.07 ±0.65）vs（5.93±0.34）,P＜0.01]。

2.2 衰老H9c2心肌細(xì)胞Omi/HtrA2表達(dá)增加，beclin1表達(dá)下降

利用Western blot方法測(cè)定細(xì)胞中Omi/HtrA2和beclin1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與H9c2心肌細(xì)胞相比，衰老的H9c2心肌細(xì)胞Omi/HtrA2表達(dá)顯著升高，而beclin1表達(dá)下降（P＜0.05；圖2）。給予Omi/HtrA2特異性抑制劑ucf-101之后，與衰老H9c2細(xì)胞比較，beclin1表達(dá)進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖2）。

2.3 H9c2細(xì)胞過(guò)表達(dá)Omi/HtrA2，自噬水平上升

利用western blot方法測(cè)定細(xì)胞中Omi/HtrA2和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與H9c2心肌細(xì)胞相比，慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞中Omi/HtrA2及LC3-Ⅱ蛋白水平均顯著升高（P＜0.05；圖3）；給予ucf-101抑制Omi/HtrA2后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下降，兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖3）。

3 討 論

圖1 H9c2心肌細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色鑒定結(jié)果Figure 1 β-galactosidase staining of H9c2 myocardiocytes (×100)A: H9c2心肌細(xì)胞對(duì)照組; B: D-半乳糖干預(yù)衰老組

衰老是一系列復(fù)雜生理及病理生理變化的過(guò)程，心臟衰老是心血管系統(tǒng)及其它器官衰老相關(guān)變化的集中體現(xiàn)，隨著衰老的進(jìn)程，這些病理改變均是各種衰老心臟疾病的病理基礎(chǔ)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞自噬水平下調(diào)是衰老心臟功能下降的重要原因，當(dāng)自噬缺陷或自噬下降時(shí)，細(xì)胞通過(guò)自噬降解消化受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性生物大分子的能力下降，因此不能維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能[1]。而在很多病理情況下，都有明顯的自噬活動(dòng)的增加，過(guò)多的自噬導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，加重心臟的損傷[10,13,14]。Beclin1基因也稱BECN1基因，是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，而上調(diào)beclin1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生[7,15]。目前所知絲氨酸蛋白酶Omi（又稱HtrA2）是一個(gè)主要定位于真核生物線粒體的絲氨酸蛋白酶，隸屬于HtrA（High Temperature Requirement）家族，具有修復(fù)、降解線粒體中折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2功能缺失動(dòng)物表現(xiàn)出劇烈的神經(jīng)退行性病變癥狀[16]，與自噬基因（Atg5/Atg7）神經(jīng)元條件性敲除的小鼠的性狀有高度的相似。本研究結(jié)果顯示：與H9c2心肌細(xì)胞對(duì)照組比較，D-半乳糖干預(yù)衰老組β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率顯著升高，表明衰老細(xì)胞模型建立成功。與H9c2心肌細(xì)胞比較，D-半乳糖干預(yù)衰老組細(xì)胞中Omi/HtrA2蛋白表達(dá)增高，beclin1表達(dá)下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致；但給予D-半乳糖干預(yù)衰老組細(xì)胞Omi/HtrA2的特異性抑制劑ucf-101后，衰老細(xì)胞中Omi/HtrA2蛋白表達(dá)明顯下降，而beclin1表達(dá)進(jìn)一步下降。但beclin1表達(dá)進(jìn)一步下降的機(jī)制并不十分清楚，可能原因是自噬水平下降，或Omi/HtrA2蛋白表達(dá)下降[17]。

圖2 Omi/HtrA2和beclin1在H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 Expression of Omi/HtrA2 and beclin1 in H9c2 myocardiocytes 1: 對(duì)照組; 2: D-半乳糖干預(yù)衰老組; 3: ucf-101組; 4: Omi/HtrA2過(guò)表達(dá)組; A,C: Western blot結(jié)果; B,D: 灰度掃描分析結(jié)果。與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與D-半乳糖干預(yù)衰老組比較,#P<0.05

圖3 LC3-Ⅱ在過(guò)表達(dá)Omi/HtrA2正常H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 Expression of LC3-Ⅱin over expressed Omi/HtrA2 H9c2 myocardiocytes 1: 對(duì)照組; 2: Omi/HtrA2過(guò)表達(dá)組; 3: ucf-101作用的對(duì)照組; 4: ucf-101作用的Omi/HtrA2過(guò)表達(dá)組; A: Western blot結(jié)果; B: 灰度掃描分析結(jié)果。與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與Omi/HtrA2過(guò)表達(dá)組比較,#P<0.05

目前已知LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8（Aut7/Apg8）基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC3有兩種分子存在形式，即LC3-I和LC3-Ⅱ。未發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過(guò)加工，成為胞質(zhì)可溶性的Ⅰ型LC3，常規(guī)表達(dá)。當(dāng)自體吞噬發(fā)生時(shí)，Ⅰ型LC3經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成Ⅱ型。LC3-Ⅱ始終位于自噬體膜上，使之成為自噬體的標(biāo)志分子，當(dāng)自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3-Ⅱ即被溶酶體中的水解酶降解。因此，LC3-Ⅱ含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比，是細(xì)胞自噬體膜的通用標(biāo)記物[18]。在免疫印記試驗(yàn)中，LC3-Ⅱ較LC3-I更加敏感。因此LC3-Ⅱ與β-actin的比值被認(rèn)為是自噬的精確指標(biāo)[6]。研究發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2在胚胎成纖維細(xì)胞及非神經(jīng)組織自噬的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，Omi/HtrA2可以促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[17,19]。本研究結(jié)果顯示：與H9c2心肌細(xì)胞比較，慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞中Omi/HtrA2表達(dá)升高，LC3-Ⅱ表達(dá)升高，即自噬水平升高；給予Omi/HtrA2的特異性抑制劑ucf-101后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下降，自噬水平下降，直接證實(shí)Omi/HtrA2促進(jìn)了H9c2心肌細(xì)胞自噬。

綜上所述，在衰老心肌細(xì)胞中Omi/HtrA2表達(dá)增加，自噬水平下降；給予Omi/HtrA2的特異性抑制劑ucf-101后，衰老心肌細(xì)胞自噬水平進(jìn)一步下降；H9c2心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)Omi/HtrA2，自噬水平上升，給予Omi/HtrA2的特異性抑制劑ucf-101后，自噬水平下降。以上提示衰老心肌中增加的Omi/HtrA2對(duì)細(xì)胞自噬具有促進(jìn)作用。這將加深對(duì)衰老心肌細(xì)胞自噬機(jī)制的理解，延緩心肌衰老提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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