崔淑芹

山東德州學院醫(yī)學系，德州 253023

長期大量飲酒可導致慢性乙醇中毒，產(chǎn)生認知障礙、行為異常、精神異常和乙醇中毒性腦病等［1－3］。認知障礙是指因腦部功能受損而產(chǎn)生的學習記憶以及思維判斷功能的異常。學習記憶是人和動物賴以生存的重要腦功能之一，學習記憶障礙是長期飲酒對人們生活健康影響最普遍和最嚴重的問題之一，目前認為最可能參與記憶痕跡形成的結構是小腦、海馬、杏仁體和大腦皮層，其中海馬在信息的獲得和儲存方面起著重要作用。研究表明，阿片肽、乙酰膽堿、γ－氨基丁酸（GABA）等多種中樞神經(jīng)遞質與學習記憶有關。本實驗通過建立慢性乙醇中毒大鼠模型，采用放射免疫分析法系統(tǒng)檢測慢性乙醇中毒及葛根素干預后大鼠皮層、海馬、小腦和紋狀體內阿片肽含量的變化，探討葛根素對慢性乙醇中毒大鼠多腦區(qū)內源性阿片肽含量的調控作用，為臨床治療慢性乙醇中毒和開發(fā)中藥葛根作為解酒藥物提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠24只（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司），56%（V／V）白酒（北京懷柔紅星股份有限公司生產(chǎn)），2%的注射用葛根素（山東瑞陽制藥有限公司），β-內啡肽（β-EP）、亮腦啡肽（L-EK）和強啡肽 A（DnyA）放免試劑盒（第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室）。

1.2 實驗分組及方法

24只雄性SD大鼠隨機分為對照組、慢性乙醇中毒組（乙醇組）和葛根素組，每組8只，自由進食。參照文獻［4］制備動物模型。慢性乙醇中毒組：用56%（V／V）白酒灌胃，第1周每天6g／kg，1次灌胃，第2、3周每天12g／kg，1次灌胃，第4周每天15g／kg，分2次灌胃。葛根素組：白酒灌胃＋葛根素腹腔注射，白酒劑量與慢性乙醇中毒組相同，葛根素劑量第1周為100mg／kg，第2、3周為150mg／kg，第4周為200mg／kg。對照組給予等容量生理鹽水灌胃及腹腔注射。

1.3 標本檢測

于實驗第4周末次給藥24h后，斷頭處死大鼠，立即取下鼠腦，在沸生理鹽水中煮5min，分離皮層、小腦、海馬和紋狀體，準確稱重，分別置于玻璃勻漿管內，加入1mol／L的 HAc 1mL，充分勻漿后轉入到塑料試管中，室溫放置100min。4℃，4 000 r／min離心20min，取上清加入1mol／L NaOH 1 mL，中和酸，按照試劑盒說明檢測β-EP、DnyA和L-EK的含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用統(tǒng)計軟件 GraphPad Prism 4.0進行統(tǒng)計分析，β-EP、DnyA和L-EK的檢測結果用±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮層、小腦、海馬、紋狀體β-EP的測定

從圖1可以看出，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)β-EP含量均低于對照組（均P＜0.01），葛根素組各腦區(qū)β-EP較慢性乙醇中毒組升高（P＜0.05，P＜0.01）或有升高趨勢（圖1A），提示葛根素對慢性乙醇中毒大鼠腦內β-EP有調節(jié)作用。

2.2 皮層、小腦、海馬、紋狀體L-EK的測定

從圖2可以看出，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)LEK含量均高于對照組（均P＜0.01），葛根素組各腦區(qū)L-EK較乙醇中毒組降低（均P＜0.01），尤其是紋狀體，該指標已接近對照組。提示，葛根素對慢性乙醇中毒大鼠腦內L-EK有抑制作用。

圖1 皮層、小腦、海馬和紋狀體β-EP含量Fig.1 Contents ofβ-EP in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

圖2 皮層、小腦、海馬和紋狀體L-EK的含量Fig.2 Contents of L-EK in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

2.3 皮層、小腦、海馬、紋狀體DnyA的測定

從圖3可以看出，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)DnyA含量均顯著高于對照組（均P＜0.01），葛根素組各腦區(qū)DnyA含量均較慢性乙醇中毒組明顯降低（均P＜0.01），在紋狀體，該指標接近正常對照組。提示，葛根素對慢性乙醇中毒大鼠腦內DnyA有抑制作用。

圖3 皮層、小腦、海馬和紋狀體DnyA的含量Fig.3 Contents of DnyA in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

2.4 葛根素對慢性乙醇中毒大鼠各腦區(qū)阿片肽調節(jié)幅度的比較

通過阿片肽相對值反映葛根素對慢性乙醇中毒大鼠各腦區(qū)阿片肽的調節(jié)幅度，阿片肽相對值（%）＝（葛根素組阿片肽含量－慢性乙醇中毒組阿片肽含量）／慢性乙醇中毒組阿片肽含量×100%。從圖4看出，葛根素對各腦區(qū)β-EP的調節(jié)幅度差異較大（圖4A），調節(jié)幅度最小為4.57%，最大則高達38.00%；葛根素對L-EK的調節(jié)幅度較小，調節(jié)幅度最大的是皮層，為17.56%（圖4B）；葛根素對DnyA的調節(jié)幅度居中，各腦區(qū)差異較小（圖4C）。

圖4 葛根素對慢性乙醇中毒大鼠各腦區(qū)阿片肽含量的調節(jié)幅度Fig.4 Regulation of puerarin on opioid peptide in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

3 討論

阿片肽的研究已有30多年的歷史，20世紀70年代，阿片肽陸續(xù)在體內外被發(fā)現(xiàn)，它所具有的類嗎啡活性掀起了科學家們的研究熱潮。阿片肽是一種神經(jīng)活性物質，有激素和神經(jīng)遞質的功能，分內源性和外源性兩種，內源性阿片肽主要包括腦啡肽（leuenkaphalin，L-EK）、內啡肽（endorphin，EP）、強啡肽（dynorphin，DnyA）、孤啡肽（orphanin FQ，OFQ）和內嗎啡肽（endomorphins，EM）等5大家族。目前對L-EK、β-EP和DnyA的研究較多，因發(fā)現(xiàn)其有激素和神經(jīng)遞質的功能，因此被稱為神經(jīng)免疫肽。傳統(tǒng)的觀點認為，阿片肽主要涉及了成癮物質如乙醇、嗎啡的強化和獎賞效應［5］。但是，近年研究發(fā)現(xiàn)阿片系統(tǒng)也參與了學習記憶，其過程非常微妙、復雜［6］。乙醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能是通過內源性阿片類物質介導的這一理論是由Davis等［7］首次提出的。他們發(fā)現(xiàn)，乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛與多巴胺的某種代謝產(chǎn)物相互作用，所產(chǎn)生的生物堿類可以和阿片受體結合產(chǎn)生阿片樣效應，除此之外，乙醇還可通過以下方式興奮內源性阿片受體：①乙醇中間代謝產(chǎn)物乙醛與兒茶酚類形成類阿片物質加和物；②乙醇可以通過多巴胺和γ－氨基丁酸等遞質系統(tǒng)引起內源性阿片類物質的釋放，間接興奮其受體；③乙醇可非特異性提高內源性阿片受體對阿片類物質的敏感性。也有動物實驗表明乙醇中毒可影響內源性阿片肽的含量和基因表達，急性乙醇攝入可以增加大腦某些區(qū)域內源性阿片肽基因的表達［8］，慢性乙醇中毒對阿片肽的影響卻有著諸多不同甚至相反的結論［9－10］，可能與實驗方法、取材部位及標本處理方式不同有關。

乙醇中毒現(xiàn)象的嚴重性引發(fā)了眾多學者對解酒藥物的研究［11－12］，解酒藥物層出不窮。在我國葛根用于解酒已有4千多年的歷史，葛根素是葛根的主要有效成分之一，因其在體內分布廣、消除快、不易積蓄等特點被廣泛用于臨床治療心腦血管疾病。葛根素對乙醇中毒腦內阿片肽的影響研究報道較少，董學妍等［13］曾報道葛根素對急性乙醇中毒下丘腦阿片肽具有調節(jié)作用，但葛根素對慢性乙醇中毒大鼠多腦區(qū)阿片肽的系統(tǒng)干預研究尚未見報道。關于葛根素調節(jié)內源性阿片肽釋放的作用機制目前還不是很清楚，推測其可能通過降低腦循環(huán)血液中乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛的濃度間接調節(jié)內源性阿片肽的釋放，還可能通過影響多巴胺和氨基酸類遞質間接調節(jié)了阿片肽物質的釋放。

本實驗結果顯示，慢性乙醇中毒組大鼠各腦區(qū)L-EK和DnyA含量顯著高于對照組，葛根素組LEK和DnyA含量較慢性乙醇中毒組降低（圖2，3），說明葛根素可能通過以上機制調節(jié)腦內L-EK和DnyA含量，對乙醇中毒大鼠腦組織產(chǎn)生保護性調控作用。β-EP的變化與L-EK和DnyA結果相反，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)β-EP的含量比對照組低，而葛根素組β-EP含量比慢性乙醇中毒組高（圖1），該結果可能與長期的乙醇攝入降低前阿黑素原基因的表達，從而減少β-EP的釋放有關［14］。對比4個腦區(qū)葛根素干預后β-EP、L-EK和DnyA含量的變化幅度（圖4）發(fā)現(xiàn)，葛根素對各腦區(qū)各指標的調節(jié)幅度不完全一致，對皮層和小腦調節(jié)幅度較小，對海馬和紋狀體調節(jié)幅度較大。海馬是記憶的主要腦功能區(qū)，其余各腦區(qū)均與機體的記憶和運動功能有關，由本實驗結果推斷：葛根素可能對乙醇中毒所致空間記憶障礙及運動功能異常有較為顯著的調控作用，詳細機制還需進一步實驗研究。

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