李艷林 鄒龍濤 王成玉 伍巧源 廖蘊(yùn)華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧市 530021)

腹膜透析難治性腹膜炎成為腹膜透析患者退出腹膜透析治療的主要原因。腹膜炎的反復(fù)發(fā)生及久治不愈與細(xì)菌生物被膜(bi of ilm，BF)的形成有關(guān)［1］。細(xì)菌BF是指細(xì)菌為了適應(yīng)周圍生存環(huán)境而形成的一種與浮游細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的存在方式，由細(xì)菌及其分泌的胞外多聚物組成，具有抵抗力強(qiáng)、耐藥性強(qiáng)等特點(diǎn)，其引發(fā)的感染常需要拔除移植物。本實(shí)驗(yàn)以腹膜透析管為載體，采用透析后無菌腹透液為培養(yǎng)液，模擬臨床腹膜透析環(huán)境建立大腸桿菌(E.coli)BF，并研究不同濃度頭孢他啶對(duì)E.coli BF的影響，從而給臨床腹膜透析BF相關(guān)感染的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 菌株:臨床分離E.coli(經(jīng)VITEK2 Systerms Version 04.02 鑒定)，編號(hào)為0407611754525610，質(zhì)控菌為ATCC25922，均由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供。載體:腹膜透析管(硅膠，美國(guó)百特公司生產(chǎn))制成1cm長(zhǎng)，經(jīng)高壓滅菌后備用。培養(yǎng)液:因慢性腎小球腎炎導(dǎo)致尿毒癥患者行持續(xù)性不臥床腹膜透析后的無菌腹膜透析液(1.5%腹透液，由美國(guó)百特公司生產(chǎn))，留取隔夜留腹10h的腹膜透析液，每袋均行腹膜透析液常規(guī)、生化及細(xì)菌培養(yǎng)檢查，均證實(shí)無污染，經(jīng)無菌操作將腹膜透析液用無菌瓶分裝，－20℃保存，1個(gè)月內(nèi)使用。實(shí)驗(yàn)試劑和器材:剛果紅(中國(guó)遠(yuǎn)航試劑廠，批號(hào)11901)，腦心浸出液肉湯BHI(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)1110262)，2.5%戊二醛、氯化鈣、硝酸銀、硫代硫酸鈉、對(duì)苯二酚，普通光學(xué)顯微鏡(BH22，日本OLYMPAS)?？咕幬?頭孢他啶(葛蘭素史克，批號(hào)K803)。

1.2 方法

1.2.1 剛果紅法鑒定 BF菌株 按照 Mrinalini等［2］文獻(xiàn)的方法，從－80℃冰箱中取出臨床分離的E.coli，用無菌接種環(huán)將其復(fù)蘇于LB瓊脂平板上，置于37℃恒溫箱，培養(yǎng)20h。挑取其中一個(gè)菌落接種于剛果紅平板上，置于37℃恒溫箱，培養(yǎng)18 h;之后置于室溫72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。若細(xì)菌菌落變黑，菌落周邊培養(yǎng)基褪色，則該菌株為BF形成菌株，原因?yàn)閯偣t染料與BF的多糖胞間黏附素結(jié)合，使得產(chǎn)多糖胞間黏附素的菌株形成黑色菌落;若細(xì)菌菌株仍為紅色，則該菌株為非BF形成菌株。

1.2.2 抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(NCCLS)所制定的方法測(cè)定頭孢他啶的MIC和MBC。

1.2.3 細(xì)菌 BF模型的建立 按文獻(xiàn)方法［3］:取出在－80℃保存的菌種，復(fù)蘇后，接種于40mL LB肉湯中，37℃，隔夜培養(yǎng)。次日清晨離心，4℃、10000rpm、10min，沉淀物用無菌生理鹽水洗滌2次。然后用培養(yǎng)液調(diào)懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?細(xì)菌數(shù)約為5×107－8CFU/Ml)，24孔板各孔加入上述液2mL，每孔置入無菌腹膜透析管載體1個(gè)，37℃恒溫培養(yǎng)，隔天換液。通過掃描電鏡鑒定，7d形成成熟BF。

1.2.4 藥物作用后BF的變化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(NCCLS)所制定的方法，測(cè)得頭孢他啶的MIC為0.5mg/L，MBC為8mg/L，即為實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度。按上述方法建模7d后加入實(shí)驗(yàn)用藥，分為空白對(duì)照組(即加等量滅菌生理鹽水)、低濃度組(1×MIC)、高濃度組(1×MBC)共3組。作用12h后，取出腹膜透析管載體，用無菌生理鹽水沖洗載體表面浮游菌，各組分別取4份腹膜透析管載體行連續(xù)稀釋涂板細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)［3］，另外各組分別取兩份行銀染法染色［4］后，顯微鏡觀察BF藥物作用前后的變化情況。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 剛果紅法鑒定BF形成菌株 對(duì)照組E.coli菌株仍為紅色，該菌株為非BF形成菌株。臨床分離的E.coli菌落變黑，菌落周邊培養(yǎng)基褪色，該菌板株為BF形成菌株。詳見圖1。

圖1 剛果紅法鑒定BF形成菌株

2.2 抗菌藥物MIC和MBC的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)測(cè)得頭孢他啶的MIC為0.5mg/L，MBC為8mg/L。

2.3 掃描電鏡觀察成熟E.coli BF的建立建模7d后，取腹膜透析管載體行掃描電鏡觀察，可見載體表面形成大片塊狀、致密的具有立體結(jié)構(gòu)的膜樣物，即形成成熟的E.coli BF。見圖2。

圖2 建模7d掃描電鏡觀察載體表面BF(×7000)

2.4 不同濃度頭孢他啶作用后E.coli BF的變化情況

2.4.1 連續(xù)稀釋涂板細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)(×105CFU/L)低濃度組(122.25±10.51)與對(duì)照組(132.17±14.12)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。高濃度組(15.28±3.88)與對(duì)照組、低濃度組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。

2.4.2 銀染法顯微鏡觀察不同濃度頭孢他啶作用后E.coli BF的變化 銀染后普通光學(xué)顯微鏡觀察，空白腹膜透析管載體表面無棉絮樣、黑色團(tuán)塊狀物，即無BF形成(見圖3A);對(duì)照組載體表面上可見大量的棉絮樣、黑色團(tuán)塊狀物，即大量的BF(見圖3B);低濃度組載體表面仍見大量棉絮樣、黑色團(tuán)塊狀物，與對(duì)照組比較BF量無明顯改變(見圖3C);高濃度組載體表面上可見棉絮樣、黑色團(tuán)塊狀物明顯減少，表明高濃度頭孢他啶作用后BF明顯減少(見圖3D)。

圖3 銀染后顯微鏡觀察載體表面BF的情況(×400)

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，生物材料的應(yīng)用逐漸增多，由此引發(fā)的相關(guān)感染發(fā)生率逐年上升［5］。腹膜透析是尿毒癥患者替代治療的方法之一，腹膜透析管的植入，為腹膜透析BF相關(guān)感染提供了條件。其中E.coli是腹膜透析相關(guān)性腹膜炎G－菌感染最常見的病原菌之一。腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的經(jīng)典治療處方為頭孢唑林和頭孢他啶的聯(lián)合配伍［6］。目前尚未見頭孢他啶對(duì)腹膜透析BF相關(guān)感染的研究。本實(shí)驗(yàn)以腹膜透析管為載體，患者透析后無菌的腹膜透析液為培養(yǎng)液，更合理的模擬臨床腹膜透析BF相關(guān)感染的環(huán)境，且建模7 d形成成熟的E.coli BF的模型。目前大多BF藥物作用的研究多采用作用24 h后觀察BF的變化，臨床腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者腹腔使用抗生素，該腹膜透析液留腹時(shí)間多為10～12 h，故本實(shí)驗(yàn)采用藥物作用12 h后觀察BF的變化。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)［7］已證實(shí)銀染法后用普通光鏡觀察BF變化的情況與用掃描電鏡觀察的結(jié)果一致。而銀染法操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，故本實(shí)驗(yàn)主要采用銀染法及連續(xù)稀釋涂板細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法觀察不同濃度頭孢他啶對(duì)E.coli BF的作用。結(jié)果顯示低濃度(1×MIC)頭孢他啶作用成熟E.coli BF后BF內(nèi)活菌數(shù)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，載體表面仍見大量棉絮樣、黑色團(tuán)塊狀物，表明低濃度頭孢他啶對(duì)E.coli BF作用不明顯;而高濃度(1×MBC)頭孢他啶作用后BF內(nèi)活菌數(shù)與對(duì)照組、低濃度組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，載體表面上棉絮樣、黑色團(tuán)塊狀物明顯減少，表明高濃度頭孢他啶能顯著減少E.coli BF內(nèi)活菌數(shù)，且能破壞BF，但未完全清除。由此可以推測(cè)臨床腹膜透析E.coli BF引起的相關(guān)感染，單用高濃度的頭孢他啶能破壞BF，但不能徹底清除。另外，目前抗生素對(duì)BF的相關(guān)研究多采用抗生素對(duì)細(xì)菌的MIC或其若干倍，較少使用MBC。本實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于BF的研究采用抗生素對(duì)細(xì)菌的MBC效果會(huì)更好。

目前腹膜透析相關(guān)性難治性腹膜炎已成為臨床醫(yī)師面臨的棘手問題，其與細(xì)菌BF的形成關(guān)系密切。本研究為臨床腹膜透析BF相關(guān)感染的的治療提供了一定的參考價(jià)值。

［1］Patel R.Bi of ilms and antimicrobial resistance［J］.Clin Orthop Related Res，2005，(437):41－47.

［2］Mrinalini S，Livia V，F(xiàn)rancesca B，et al.Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal bi of ilms［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2008，52(1):299－305.

［3］王成玉，梁 俐，伍巧源，等.在腹膜透析液及LB液環(huán)境中腹膜透析留置大腸桿菌生物被膜形成能力的對(duì)比［J］.內(nèi)科，2011，6(5):397－399.

［4］Passariello C，Berlutti F，Selan L，et al.A rapid staining procedure to demonstrate glycocalyx production and bacterial bi of ilms［J］.The New Microbiological，1994，17(3):225－230.

［5］Borriello G，Richards L，Ehrlich GD，et al.Arginine or nitrate enhances antibiotic susceptibility ofPseudomonas aeruginosain bi of ilms［J］.Antimicrob Agents Chemotherapy，2006，50(1):382－384.

［6］韓慶烽，汪 濤.腹膜透析相關(guān)性腹膜炎［J］.中國(guó)血液凈化，2007，6(12):642－644.

［7］梁 俐，王成玉，鄒龍濤，等.銀染法觀察大腸桿菌生物被膜變化的初探［J］.內(nèi)科，2012，7(2):95－97.