李 佳，林 燕，陳敏杰，張 捷，李 正，梁 勇，3*

（1.江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.江漢大學(xué) 光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430056）

0 引言

富勒烯及其衍生物的生物學(xué)效應(yīng)以及在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用是目前富勒烯研究的熱點領(lǐng)域。富勒烯的生物學(xué)及醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要包括抗氧化劑［1］，抗病毒［2］，神經(jīng)保護蛋白［3-4］，酶抑制劑［5-7］，抑制離子通道［8］，抑制淀粉樣蛋白的形成［9］以及成像和核藥物等。有研究表明，富勒烯衍生物可顯著抑制HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性［2］，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

但是，也有研究表明富勒烯及其衍生物可改變核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的構(gòu)象，影響其生物學(xué)功能，進而引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。如與核酸分子（DNA）相互作用，包括選擇性剪切DNA雙鏈［7］，并且在光催化條件下引起質(zhì)粒DNA構(gòu)象的改變［10-12］；與蛋白質(zhì)和酶的相互作用，改變酶活性，進而顯著性抑制多種酶活性，如Taq DNA聚合酶［13］、谷胱甘肽還原酶［6］、乙酰膽堿酯酶［14］、半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶）和絲氨酸蛋白酶等（胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶和凝血酶等）等，同時也與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，如富勒烯特異結(jié)合的抗體蛋白［15］、人血清白蛋白、牛血清蛋白［16-18］和溶菌酶［19］；光催化引發(fā)細(xì)胞損傷和基因毒性等［20］。目前有些研究者認(rèn)為，富勒烯及其衍生物對DNA損傷效應(yīng)，主要與富勒烯產(chǎn)生的活性氧和自由基相關(guān)。富勒烯及其衍生物影響蛋白質(zhì)或酶生物學(xué)功能，主要原因包括富勒烯及其衍生物與酶結(jié)合后，改變酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶與底物無法結(jié)合；富勒烯及其衍生分子直接進入酶活性部位的腔體內(nèi)，占據(jù)酶活性位點，阻礙底物的進入［21］；富勒烯及其衍生物結(jié)合到蛋白酶的亞基上，阻礙蛋白酶必需的功能性旋轉(zhuǎn)運動，進而抑制酶活性［22］；富勒烯產(chǎn)生的活性氧和自由基攻擊蛋白質(zhì)或酶，破壞其空間結(jié)構(gòu)，最終影響其生物學(xué)功能［5，23-24］。然而有關(guān)富勒烯與RNA相互作用的研究報道較少，有待進一步研究并闡明其相關(guān)作用機制，為富勒烯及其衍生物在醫(yī)學(xué)臨床上的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

RNA是一種生物大分子，它參與蛋白質(zhì)合成和基因的表達調(diào)控，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中生物遺傳信息傳遞的重要中間載體。對于一部分病毒來說，RNA是唯一的遺傳物質(zhì)。它存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，也存在于一些植物病毒和動物病毒以及噬菌體內(nèi)。目前，國內(nèi)外已有不少學(xué)者進行了靶向納米材料作為siRNA載體的相關(guān)研究，頗有成效。Zhang等［25］合成-CONH-（CH2）6-NH3+Cl修飾的單壁碳納米管（SWNT）復(fù)合物能夠?qū)iRNA轉(zhuǎn)運到腫瘤細(xì)胞中，siRNA從SWNT的壁上脫離下來，用以沉默目標(biāo)基因。Lu等［26］利用放射性同位素標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SWNT可轉(zhuǎn)移到MCF7乳腺癌細(xì)胞中。通過非特異性結(jié)合機制雜交的SWNT和RNA-poly（rU）聚合物，其中poly（rU）在運載過程中可從SWNT上解離下來；另外，通過對細(xì)胞生長活性MTS的檢測，研究者發(fā)現(xiàn)SWNT對MCF7細(xì)胞具有一定毒性作用。因此，碳納米材料進入細(xì)胞內(nèi)，勢必會與RNA相互作用，干擾正常的蛋白質(zhì)合成以及基因的表達調(diào)控等，引起細(xì)胞代謝紊亂，進而引起基因毒性效應(yīng)或細(xì)胞死亡。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是在體外以mRNA為模版，以O(shè)ligo-dT為引物以及逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，并對某一特定DNA片段進行快速擴增的一種技術(shù)。本研究以RT-PCR為體外實驗?zāi)Ｐ?，研究富勒烯對RT反應(yīng)的影響，旨在評估碳納米材料對生物體產(chǎn)生毒性作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

試劑：C60購自ALDRICH公司（純度為99.9%），Trizol購自Invitrogen，Carlsbad，CA；焦碳酸二乙酯購自DUCHAFA公司；乙醇、異丙醇和三氯甲烷為分析純試劑，購自上海國藥集團；引物Oligo-dT購自上海生工公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）、dNTP購自Promega公司；溴化乙錠購自Fluka公司；瓊脂糖（G-10）購自BIOWEST公司；2×Taq PCR Mastermix，DNA上樣緩沖溶液、RNA上樣緩沖溶液、DNA分子量標(biāo)記Marker I均購自TIANGEN公司。

儀器：超聲波儀（型號KQ-500B，昆山市超聲儀器有限公司）；PCR儀（TC-312，TECHNE公司）；超純水儀（BARNSTEAD NANOPURE，Thermo Scientific公司）；臺式高速冷凍離心機（5417R，Eppendorf公司）；核酸測定儀（6361，Eppendorf公司）；水平電泳槽（型號為DYCP-31C，北京六一公司）；電泳儀（型號為DYY-5，北京六一公司）；凝膠成像儀（JD-801，江蘇捷達科技公司）。

1.2 斑馬魚魚肝RNA的提取

為了研究C60對RNA逆轉(zhuǎn)錄的影響，取斑馬魚幼魚魚肝勻漿后，用于制備總RNA，Trizol試劑用于提取總RNA。核酸測定儀測定總RNA的濃度及純度，記錄A260和A260/A280的比值。RNA提取后應(yīng)立即做逆轉(zhuǎn)錄或放入冰箱-80℃保存。

1.3 C60對RNA逆轉(zhuǎn)錄的影響

為考察C60對逆轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）的影響，在20μL RT反應(yīng)體系加入一定濃度C60。RT 反應(yīng)體系：1μg RNA，2μL Oligo-dT，1μL不同濃度的C60，最后用DEPC水補齊總反應(yīng)體系13μL，C60終濃度分別為10、50和100μg/mL。充分混勻后72℃反應(yīng)5 min，冰上靜置5 min。然后向PCR管中依次加入 3μL dNTP（5 mmol/L），1μL M-MLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 （200 U/μL），5μL RT-MLV Buffer（5×），最后用DEPC水補齊總反應(yīng)體系25μL。RT反應(yīng)條件：42℃反應(yīng)1 h。

用軟件primer premier 5.0設(shè)計斑馬魚看家基因β-actin引物，引物序列（上游引物：5’-CAACAGAGAGAAGATGACACAGATCA-3’；下游引物：5’-GTCACACCATCACCAGAGTCCATCAC-3’）。以cDNA為模板，β-actin為引物PCR，PCR體系：1μL cDNA，1μL上游引物（2μmol/L），1μL下游引物（2μmol/L），10μL 2×PCR SuperMix，最后用無菌水補齊總反應(yīng)體系20μL。在對照組實驗中，RT反應(yīng)體系中不含C60，而在PCR反應(yīng)體系中加入濃度 0.5、2.5 和 5μg/mL C60。PCR 條件：預(yù)變性 95℃/5 min，變性 94℃/10 s，退火55℃/10 s，延伸72℃/30 s，35個循環(huán)，再延伸72℃/5 min。

1.4 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量對C60抑制RT的影響

為考察C60對M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶活性的影響，增加RT反應(yīng)體系中M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的含量，并加入 80μg/mL C60。RT反應(yīng)體系：1μg RNA，2μL Oligo-dT，1μL 不同濃度的C60，最 后 用DEPC水補齊總反應(yīng)體系13μL。充分混勻后離心，72℃反應(yīng)5 min后，冰上靜置5 min。向PCR管中依次加入 3μL dNTP（5 mmol/L），1、2或 4μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL），5μL RT-MLV Buffer（5×），最后用 DEPC 水補齊總反應(yīng)體系25μL。在對照組實驗中，RT反應(yīng)體系中添加不同含量的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。RT反應(yīng)條件：42℃反應(yīng)1 h。

以 cDNA為模板 PCR，PCR體系：1μL cDNA，1μL上游引物（2μmol/L），1μL下游引物（2μmol/L），10μL 2×Taq PCR MasterMix，最后用無菌水補齊總反應(yīng)體系20μL。PCR條件：預(yù)變性95℃/5 min，變性94℃/10 s，退火55℃/10 s，延伸72℃/30 s，35個循環(huán)，再延伸72℃/5 min。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 C60對RNA構(gòu)象的影響

為了研究C60對RNA構(gòu)象的影響，將所有孵育實驗均避光進行，反應(yīng)體系：1μL RNA，5或10μL C60，最后用DEPC H2O將體系補齊到20μL，C60終濃度為5、10和50μg/mL?；旌暇鶆蚝?，用封口膜將PCR管蓋封好。放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)12 h，孵育完成后立即使用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳

稱取0.4 g瓊脂糖于錐形瓶中，加40 mL TAE（1×）緩沖液，電爐上加熱沸騰兩次后，取下冷卻至50～60℃。加2μL EB（10 mg/mL），混勻，小心倒入膠槽，避免出現(xiàn)氣泡，插上梳子，凝固后放入裝有TAE電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)。將1μL溴酚藍(lán)和5μL PCR產(chǎn)物充分混合后，小心加入點樣孔內(nèi)，電壓100 V，電泳約30 min。電泳結(jié)束后用捷達凝膠成像系統(tǒng)采集照片，利用JD凝膠分析軟件計算DNA條帶光密度。

2 結(jié)果

2.1 C60對RNA RT反應(yīng)的影響

在基因表達差異檢測中，β-actin mRNA因其高豐度經(jīng)常被作為一種內(nèi)源性的標(biāo)準(zhǔn)，以判斷每一樣品中RNA的改變情況。本文以斑馬魚魚肝mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在RT反應(yīng)體系中添加一定濃度的C60，研究C60對RNA逆轉(zhuǎn)錄的影響。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)PCR反應(yīng)體系中不含C60時，瓊脂糖凝膠電泳顯示138 bp大小的PCR產(chǎn)物（圖1，泳道1所示）。而在RT反應(yīng)體系中加入C60的實驗組（圖1，泳道5、6和7），PCR產(chǎn)物生成受到明顯抑制，并且C60對PCR產(chǎn)物的抑制作用具有濃度依賴性。另外，由于實驗中RT體系中添加的富勒烯并沒有去除，而是隨cDNA帶入到PCR體系中，于是在隨后的PCR體系中添加富勒烯對照實驗。通過計算，在RT體系中加入10、50和100μg/mL C60時，被帶入PCR反應(yīng)體系中的C60濃度依次為0.5、2.5和5μg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)對照組（圖1，泳道2、3和4）與陰性對照組（圖1，泳道1）相比，PCR產(chǎn)物無明顯差異。以上實驗結(jié)果表明C60能夠顯著抑制RT反應(yīng)且與C60濃度密切相關(guān)。

圖1 C60對RNA RT反應(yīng)的影響

2.2 C60對RNA構(gòu)象的影響

為了進一步研究C60抑制RT反應(yīng)的作用機制，本研究將C60與RNA在37℃下反應(yīng)，探討C60對RNA構(gòu)象的影響，結(jié)果如圖2所示。實驗組與對照度相比，C60可顯著降解28S rRNA，并且C60對RNA的損傷作用具有濃度依賴性。實驗結(jié)果表明C60對RNA具有一定損傷作用，因此，在RT反應(yīng)中，減少cDNA的合成量，最終導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的減少。

圖2 不同濃度C60在37℃避光條件下對RNA構(gòu)象的影響

2.3 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量對C60抑制RT的影響

為了探討C60對RT抑制效應(yīng)的作用機制，本研究設(shè)計了M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的補償實驗，即在RT反應(yīng)體系中添加100μg/mL C60的情況下，增大體系中M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量，觀察逆轉(zhuǎn)錄酶是否能夠逆轉(zhuǎn)C60對RT的抑制作用，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)體系中不含C60，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量依次是200、400和600U時，可以觀察到逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量對PCR產(chǎn)物量沒有明顯影響（如圖3中泳道1、2和3所示），而當(dāng)反應(yīng)體系中添加100μg/mL C60時，逆轉(zhuǎn)錄酶可以逆轉(zhuǎn)C60對RT的抑制作用，并且隨著M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量增加，PCR產(chǎn)物顯著增加（圖3中泳道5、6和7所示）。實驗結(jié)果表明，C60可顯著抑制M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，在RT反應(yīng)中減少cDNA的合成量，最終導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的減少。

圖3 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的酶量對C60抑制RT的影響

3 討論

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性的大小主要取決于酶構(gòu)象的穩(wěn)定性，尤其是逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性位點的構(gòu)象。大量研究表明在光催化條件下，富勒烯衍生物可生成多種活性氧物質(zhì)［11-12，27］，造成 DNA損傷和脂質(zhì)過氧化，以及蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變［16-18］。本研究發(fā)現(xiàn)C60在非光催化條件下，不僅可以抑制M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，同時也可顯著降解28S rRNA，表明C60對RNA有一定損傷作用。C60抑制M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性下降，從而抑制RT反應(yīng)，降低cDNA合成量，進而引起PCR產(chǎn)物顯著下降?？赡艿慕忉層校篊60與酶結(jié)合后，改變酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶與底物無法結(jié)合；C60直接進入酶活性部位的腔體內(nèi)，占據(jù)酶活性位點，阻礙底物的進入［21］；C60與酶的亞基結(jié)合后，阻礙蛋白酶必需的功能性旋轉(zhuǎn)運動，進而抑制酶活性［22］；C60產(chǎn)生的活性氧和自由基直接攻擊蛋白質(zhì)或酶，破壞其空間結(jié)構(gòu)，最終影響其生物學(xué)功能［5，23-24］。

C60不僅可與M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶相互作用，同時也可顯著降解28S rRNA，表明C60對RNA構(gòu)象的影響具有空間結(jié)構(gòu)特異性?？赡艿慕忉屖牵篊60可能與28S rRNA相互作用，改變RNA構(gòu)象，造成RNA構(gòu)象不穩(wěn)定，致使RNA斷裂；在RT的反應(yīng)過程中，由于C60特殊的表面特性，它可在RT反應(yīng)中生成多種活性氧物質(zhì)或自由基，ROS攻擊RNA，造成RNA的損傷。

另外，在RT反應(yīng)過程中，由于C60的小尺寸效應(yīng)，有可能阻礙M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶與mRNA的結(jié)合，干擾Oligo-dT與mRNA的結(jié)合，干擾dA、dT、dG和dC在RNA在逆轉(zhuǎn)錄過程中的延伸反應(yīng)，降低RT反應(yīng)效率，在較高C60濃度作用下，完全抑制RT反應(yīng)。

本研究中利用mRNA體外逆轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果證實，C60可以抑制M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性，同時對RNA有一定損傷作用，說明C60存在一定的基因毒性。但是本研究體系相對簡單，相比生物體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，缺少反饋和修復(fù)機制等。因此，應(yīng)該利用多種模型進行生物活體實驗，更進一步研究C60對生物體的毒性效應(yīng)并深入探討其潛在的致毒機制。同時，C60及其衍生物應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)當(dāng)重視富勒烯和其他碳納米材料的潛在毒性效應(yīng)。

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