胡鵬，胡國(guó)洲，陳光靜，索化夷，闞建全，2，3

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715)

生物胺是一類具有生物活性的低分子量含氮有機(jī)化合物，食品中的生物胺主要由微生物氨基酸脫羧酶對(duì)氨基酸進(jìn)行脫羧作用而形成［1］。生物胺是動(dòng)物、植物和多數(shù)微生物體內(nèi)的生理物質(zhì)，適量的生物胺具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝活力、加強(qiáng)腸道免疫系統(tǒng)、控制血壓和消除自由基等生理功能［2］。但是高濃度的生物胺會(huì)嚴(yán)重影響食品風(fēng)味甚至改變其成分，還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用，造成人體神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷?？赡芎懈邼舛壬锇返氖称钒?易被微生物侵染的肉制品、魚類、奶酪、發(fā)酵飲料、發(fā)酵肉制品和發(fā)酵豆制品［3－5］。由于生物胺具有潛在的毒性，目前食品中的生物胺已成為研究的熱點(diǎn)問題。

豆豉具有較高的食用價(jià)值和一定的藥理作用，是廣大人民喜愛的佐餐佳品［6］。永川豆豉是中國(guó)豆豉四大品系中毛霉型豆豉的代表產(chǎn)品。隨著對(duì)食品安全重視程度的增加，生物胺在中外傳統(tǒng)發(fā)酵食品中含量也越來越受到關(guān)注，但是有關(guān)豆豉中生物胺的研究目前還缺乏。目前建立的生物胺分析方法主要有:薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氨基酸分析法［7］。本課題主要研究永川豆豉制曲過程中生物胺的種類和含量的變化，并同時(shí)跟蹤研究在制曲過程中水分、總酸和氨基酸態(tài)氮等基本成分的變化，以期對(duì)永川豆豉制曲成熟及豉曲的品質(zhì)及安全控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)原料為永川豆豉食品有限公司經(jīng)天然制曲，取自處于不同制曲時(shí)間的永川毛霉型豆豉。原料大豆產(chǎn)地黑龍江省。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、2－苯乙胺、組胺、酪胺、苯甲酰氯 (純度98%以上)，美國(guó)Sigma公司;甲醇(色譜級(jí))，天津四友精細(xì)化工廠;高氯酸(分析純)、HCl(分析純)重慶川東化工有限公司;甲醛溶液(分析純)、NaOH(分析純)、NaCl(分析純)，成都科龍化工試劑廠;水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC－10A高效液相色譜儀(含紫外檢測(cè)器)，日本島津公司;Milli－Q超純水器，美國(guó)Millipore公司;可調(diào)式氮吹儀，北京中諾遠(yuǎn)東公司;微型漩渦混合儀，滬西分析儀器廠;臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;FS－2可調(diào)高速勻漿機(jī)，江蘇金壇科析儀器有限公司;DK－8D三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;磁力加熱攪拌器，常州澳華儀器有限公司;PH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 生物胺的HPLC測(cè)定方法

1.3.1 樣品的衍生

2 mL的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，加入1 mL 2 mol/L NaOH，10 μL 苯甲酰氯，然后旋渦振蕩30 s，在黑暗中置于30℃水浴條件下避光反應(yīng)40 min，期間每隔10 min振蕩1次。反應(yīng)完后用2 mL飽和NaCl溶液中斷反應(yīng)。然后用3 mL乙醚萃取，1 200 r/min離心10 min，用移液槍移取乙醚層，再重復(fù)1次，將乙醚層移置于規(guī)格為10 mL的離心管中，35℃下氮?dú)獯蹈?，然后? mL甲醇(色譜級(jí))溶解，微濾(0.45 μm)后用于測(cè)定生物胺含量［8］。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)生物胺溶液的配制

準(zhǔn)確稱取腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、2-苯乙胺、組胺、酪胺各50 mg，用0.1 mol/L的HCl定容至50 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用。

分別取以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1 mol/L HCl配制成終濃度分別為 1.0、2.0、5.0、10、20、40、80 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后按1.3.1方法進(jìn)行衍生處理和分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品預(yù)處理

稱取10.0 g用研缽研磨均勻的豆豉樣品，置于100 mL離心管中，加20 mL 0.4 mol/L HClO4溶液分散，用勻漿機(jī)勻漿1 min，振蕩提取5 min，靜置5 min，然后在6 800 r/min離心30 min;將上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL HClO4溶液重復(fù)提取1次，上清液合并，用0.4 mol/L HClO4溶液定容至50 mL，取2 mL該溶液按1.3.1中的方法衍生處理。

1.3.4 液相色譜分析條件［9］

色譜柱:Agilent XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇;梯度洗脫(洗脫條件:0～5 min，40%A;5～10 min，40%A→35%A;10～15 min，35%A→30%A;15～20 min，30%A→25%A;20～25 min，25%A→15%A;25～30 min，15%A→5%A;30 ～35 min，5%A→0%A;35 ～36 min，0%A→40%A;36 ～45 min，40%A);流速為1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;進(jìn)樣量20 μL;柱溫 30℃。

1.4 理化指標(biāo)測(cè)定方法

水分含量測(cè)定:采用常規(guī)的烘箱干燥法，見GB/T 5009.3 －2003［10］;總酸含量測(cè)定:采用酸堿滴定的酸度計(jì)法［11］;氨基態(tài)氮含量測(cè)定:采用甲醛滴定法，見 SB/T 10170 －2007［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

通過單個(gè)生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC檢測(cè)，得到8種生物胺的保留時(shí)間。其中，腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、精胺、組胺、酪胺的保留時(shí)間分別為7.068 min、8.144 min、9.826 min、11.490 min、12.778 min、18.346 min、20.359 min和23.980 min。混合生物胺的HPLC檢測(cè)結(jié)果可以得出該方法對(duì)8種生物胺的分離效果較好(見圖1)。8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見表1，R2均在0.993 1～0.999 7，說明8種生物胺的峰面積與其相應(yīng)濃度呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性。

圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of biogenic amines standards

表1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及R2Table 1 Regression equation and R2of biogenic amines standard curve

2.2 制曲過程中豆豉水分含量的變化

由圖2可知，永川豆豉制曲過程中水分含量呈明顯下降的趨勢(shì)。制曲過程0天時(shí)水分含量最高，為46.97%，到制曲過程第11天時(shí)水分含量最低，已降至33.75%，這是由于制曲過程中水分蒸發(fā)、微生物利用等原因造成的。

圖2 永川豆豉制曲過程中水分含量的變化Fig.2 Water content change during Yongchuan douchi koji processing

2.3 制曲過程中豆豉總酸含量的變化

總酸含量直接影響永川豆豉制曲過程中各種酶的活性，也間接影響微生物的生長(zhǎng)代謝，從而對(duì)豉曲質(zhì)量的好壞也產(chǎn)生很大的影響。由圖3可知，永川豆豉制曲過程中總酸的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，大豆蒸煮結(jié)束時(shí)的總酸含量為1.53 g/100 g，到制曲過程第8天時(shí)總酸含量達(dá)到最高，為5.05 g/100 g，而到第11天時(shí)已降至4.27 g/100 g。這是由于制曲前期部分細(xì)菌得到一定程度生長(zhǎng)導(dǎo)致酸性代謝物質(zhì)增多，從而使總酸含量增大，但隨著蒸發(fā)，水分含量下降、毛霉大量繁殖使豆豉總酸含量下降。

圖3 永川豆豉制曲過程中總酸值的變化Fig.3 Total acid value change during Yongchuan Douchi koji processing

2.4 制曲過程中豆豉氨基態(tài)氮含量的變化

在豆豉成熟過程中，氨基酸態(tài)氮含量高低是判斷豆豉是否成熟的重要指標(biāo)。如圖4所示，永川豆豉在制曲過程中氨基酸態(tài)氮含量呈先增加后下降的趨勢(shì)。到第8天時(shí)氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，為0.55 g/100 g，隨后氨基酸態(tài)氮含量有所降低。

圖4 永川豆豉制曲過程中氨基態(tài)氮含量的變化Fig.4 Amino nitrogen content change during Yongchuan Douchi koji processing

2.5 永川豆豉制曲過程中單種生物胺含量的變化

永川豆豉在制曲過程中生物胺含量變化見表2。在永川豆豉制曲過程中共檢測(cè)出7種生物胺，分別是腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、組胺、酪胺，而精胺在整個(gè)制曲過程中都沒有檢出。在各個(gè)制曲階段，腐胺的含量都是最高的，其次是尸胺和組胺。永川豆豉制曲過程中各種生物胺含量都在不斷變化，色胺、2-苯乙胺由最初的未檢出分別增加到53.59 mg/kg、52.02 mg/kg;組胺也由制曲初期的18.49 mg/kg減少到幾乎為0;酪胺也由最初的未檢出緩慢增長(zhǎng)到20.57 mg/kg，隨后含量降到幾乎為0;腐胺含量變化呈緩慢的增長(zhǎng);各種生物胺含量均在60 mg/kg以下。美國(guó)食品藥品監(jiān)督局規(guī)定了水產(chǎn)品中組胺含量為不得超過 50 mg/kg［12］。Nout等［13］認(rèn)為發(fā)酵食品中 2-苯乙胺含量在30 mg/kg以上就可對(duì)人體構(gòu)成潛在的危險(xiǎn)?？梢娪来ǘ刽谥魄^程中組胺含量一直低于對(duì)人體產(chǎn)生危害的上述含量值50 mg/kg，但制曲后期2－苯乙胺含量高于上述含量值30 mg/kg。

表2 制曲過程中永川豆豉生物胺的濃度(mg/kg)Table 2 Contents of biogenic amines during Yongchuan Douchi koji processing

2.6 制曲過程中豆豉生物胺總量的變化

對(duì)不同制曲時(shí)間的永川豆豉進(jìn)行檢測(cè)，能檢出7種生物胺，只有精胺未能檢出。如圖5所示，制曲過程中生物胺總量初期上升后期下降，變化范圍在108.64～234.37 mg/kg。制曲0天時(shí)生物胺總量最低為108.64 mg/kg，制曲第8天生物胺總量上升到最高值，為234.37 mg/kg，隨后生物胺總量開始下降。Santos［14］認(rèn)為食品中生物胺總量超過1 000 mg/kg會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大威脅?？梢娭魄^程中豆豉生物胺總量一直低于對(duì)人體產(chǎn)生危害的上述含量值1 000 mg/kg。生物胺總量的變化趨勢(shì)基本與氨基酸態(tài)氮基本一致，這與其他相關(guān)報(bào)道的結(jié)果一致［15－16］。

圖5 永川豆豉制曲過程中生物胺總量的變化Fig.5 Total biogenic amine content change during Yongchuan Douchi koji processing

3 結(jié)論

永川豆豉在制曲過程中，水分含量呈下降趨勢(shì)，由最初的46.85%降到33.75%;總酸和氨基態(tài)氮的含量均呈先增加后下降的趨勢(shì)。制曲過程中共檢測(cè)出7種生物胺，分別是腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、組胺、酪胺，而精胺在整個(gè)制曲過程中都沒有檢出。制曲過程中豆豉中主要以腐胺、色胺和2-苯乙胺為主，含量分別達(dá)到59.67、53.59、52.02 mg/kg，三者共占生物胺總量的78.81%，所有生物胺含量均在60 mg/kg以下。為了深入了解永川豆豉制曲過程中生物胺的變化的原因，生物胺產(chǎn)生機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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