張琦，李文，林燕，馬海元，王欣澤，孔海南

1(上海交通大學環(huán)境科學與工程學院，上海，200240)2(長安大學環(huán)境科學與工程學院，陜西 西安，710064)

在合理控制情況下，高濃度乙醇發(fā)酵(濃醪發(fā)酵)能夠有效提高設備利用率、減少單位產(chǎn)物所消耗的能源，并降低雜菌污染的風險，是提高乙醇發(fā)酵生產(chǎn)效率、降低成本的有效工藝手段。然而，高濃度基質(zhì)和產(chǎn)物對酵母菌的抑制作用導致菌體發(fā)酵性能低下，進而限制最終目標產(chǎn)物濃度［1］，仍是制約其工業(yè)化推廣的重要因素。

本文分別分析在酵母菌乙醇發(fā)酵過程中基質(zhì)和產(chǎn)物對酵母菌性能的影響，系統(tǒng)研究酵母菌在不同抑制物濃度下的生長和發(fā)酵性能的變化規(guī)律，并且比較了實際發(fā)酵過程中酵母自身所產(chǎn)的內(nèi)源乙醇與實驗中外源添加的乙醇對酵母菌發(fā)酵性能影響的差異，確定抑制物的作用閾值以及高濃發(fā)酵過程中的主要限制因子，為尋找減小抑制物對于酵母菌性能影響的有效措施，進一步提高木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)效率和產(chǎn)物濃度提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742(－60℃保存，上海交通大學環(huán)境科學與工程學院生物實驗室提供)。

1.1.2 生長培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基［2］，pH 4.0 ～5.0。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基［3－4］

NH4Cl 3.0 g/L;KH2PO40.7 g/L;MgSO4·7H2O 0.35 g/L;CaCl20.1 g/L;NaCl 0.1 g/L;MnSO4·4H2O 0.11 g/L;CuSO4·5H2O 1.0 mg/L;ZnSO4·7H2O 21.0 mg/L;CoSO4·7H2O 4.0 mg/L;H3BO340.0 mg/L;Na2MoO4·2H2O 0.2 mg/L;FeSO414.4 mg/L。

1.1.4 發(fā)酵基質(zhì)

木質(zhì)纖維素的水解液中，葡萄糖占還原糖絕對比例可達70%［5］，需著重研究以提高酵母菌對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，故本研究采用葡萄糖作為發(fā)酵基質(zhì)。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

復蘇后的酵母菌置于YPD液體培養(yǎng)基擴培，于全溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進行，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37℃，培養(yǎng)16～18 h。

1.2.2 間歇發(fā)酵

按既定濃度的酵母菌、營養(yǎng)液、基質(zhì)和產(chǎn)物配制發(fā)酵反應液，而后將其置于集成控制自動化厭氧發(fā)酵罐內(nèi)進行發(fā)酵，設置參數(shù)為pH 4.0，35℃，200 r/min，菌體濃度2 g/L。每批次實驗均平行啟用3個發(fā)酵罐同時同參數(shù)反應以控制誤差。

1.3 樣品分析方法

菌體濃度采用分光光度法檢測［6－7］，檢測波長選用600 nm;基質(zhì)(葡萄糖)和產(chǎn)物(乙醇)檢測條件:島津液相色譜儀，色譜柱BIO-RAD 910－5250，柱溫65℃，RID－10A檢測器，溫度60℃，流動相超純水，流速:0.8 mL/min，進樣量 20 μL。

2 實驗分析與討論

2.1 高濃度基質(zhì)對乙醇發(fā)酵的抑制

高濃發(fā)酵能夠提高設備利用率，減少熱能消耗和用水量，有效降低生產(chǎn)成本。但過高基質(zhì)濃度所致的高滲環(huán)境，會減弱酵母菌細胞膜流動性及胞內(nèi)關鍵代謝酶活性［9－10］，從而降低酵母菌乙醇發(fā)酵性能。當基質(zhì)濃度高于閾值后，繼續(xù)提高基質(zhì)濃度，產(chǎn)物將增長緩慢甚至停滯，造成原材料浪費。通過基質(zhì)對酵母菌活性抑制作用的研究，能確定合理的基質(zhì)投加量，在保證基質(zhì)利用率及乙醇產(chǎn)率的前提下獲取最高的經(jīng)濟效益。

實驗中，設置的基質(zhì)濃度分別為:40、80、120、160、200、280 g/L。每批次發(fā)酵時間 96 h，每隔 24 h取樣。

2.1.1 基質(zhì)對酵母菌生長的影響

圖1為不同基質(zhì)濃度下酵母菌濃度變化的對比圖。當基質(zhì)濃度低于160g/L時，菌體濃度隨著基質(zhì)濃度的提高而顯著增加。這是因為葡萄糖是酵母細胞最重要的碳源，亦是重要的初期信號分子，酵母菌會根據(jù)外界基質(zhì)變化來調(diào)節(jié)自身各種酶的表達水平及活性，達到最佳的代謝生長水平，最終達到最適種群密度［9］。所以在基質(zhì)濃度較小時，不斷提高的基質(zhì)濃度改善了酵母菌的營養(yǎng)條件，酵母菌濃度隨之增長。

圖1 不同基質(zhì)濃度下酵母菌濃度隨時間變化Fig.1 Variation of yeast concentration under different substrate concentration

當基質(zhì)濃度大于160 g/L時，在反應初期，酵母菌對高滲環(huán)境作出應激反應，迅速提高種群密度以加快基質(zhì)的總消耗速率，改善高滲環(huán)境，因而在前24小時有著較高的增長速率。但由于高濃度基質(zhì)對酵母菌細胞膜流動性及胞內(nèi)關鍵代謝酶的抑制作用，后期菌體增長速率明顯放緩。比較發(fā)酵96 h內(nèi)酵母菌的最大濃度，繼續(xù)提升基質(zhì)濃度，菌體濃度反而略有減小，可見高濃度基質(zhì)對酵母菌生長繁殖存在一定的抑制作用。

圖2為基質(zhì)濃度與平均對基質(zhì)菌體得率擬合圖，隨著基質(zhì)濃度的逐漸升高，平均對基質(zhì)菌體得率顯著減小，即消耗單位的葡萄糖所生成的細胞數(shù)量逐漸下降，更多的葡萄糖消耗用以維持細胞能量，印證了高基質(zhì)濃度對菌體生長繁殖的抑制作用。初始基質(zhì)濃度S0和平均對基質(zhì)菌體得率YX/S呈對數(shù)關系［11］，具體如下式。

圖2 基質(zhì)濃度與平均對基質(zhì)菌體得率擬合圖Fig.2 Fitting of substrate concentration and average yeast yield to substrate

2.1.2 基質(zhì)濃度對酵母菌乙醇發(fā)酵性能的影響

圖3是不同基質(zhì)濃度下發(fā)酵所得最大乙醇濃度變化曲線，基質(zhì)濃度小于160 g/L時，產(chǎn)物濃度隨基質(zhì)增加顯著提高;但當濃度大于160 g/L后，繼續(xù)增加基質(zhì)，最終乙醇濃度未見明顯增長，一直穩(wěn)定在53 g/L左右。因此，高于160 g/L的基質(zhì)濃度對于乙醇發(fā)酵無實際意義，僅造成原材料的浪費。

圖3 不同基質(zhì)濃度下最大乙醇濃度變化Fig.3 Maximum ethanol concentrations under different substrate concentration

圖4是不同基質(zhì)濃度下乙醇產(chǎn)率隨時間變化關系圖。隨基質(zhì)濃度增加，發(fā)酵所需時間相應增加:80 g/L至200 g/L時，反應需72 h，而280 g/L時，發(fā)酵96 h仍未完成。實驗結(jié)果表明除了發(fā)酵負荷增加外，高濃度基質(zhì)對酵母菌發(fā)酵活性的抑制亦是導致酵母菌性能下降及發(fā)酵反應時間延長的主要原因。

圖4 不同基質(zhì)濃度下乙醇產(chǎn)率變化Fig.4 Comparison of ethanol yields under different substrate concentration

就乙醇產(chǎn)率(實際乙醇產(chǎn)量與理論乙醇最大產(chǎn)量之比)而言，基質(zhì)濃度為80 g/L時在48h能達到84%乙醇產(chǎn)率，而在72 h時，產(chǎn)率進一步提升至94%，乙醇最終濃度可達40 g/L，達到了營養(yǎng)條件與滲透壓的平衡，是最佳的發(fā)酵基質(zhì)濃度。但在實際工業(yè)生產(chǎn)過程中，并非追求最高的乙醇產(chǎn)率，而是單位時間內(nèi)單位生產(chǎn)設備所產(chǎn)生的乙醇總量。因而即使最終產(chǎn)率略低，只要同生產(chǎn)一周期內(nèi)最終獲得更高的乙醇濃度，又不至于造成基質(zhì)的大量浪費，才是符合生產(chǎn)工藝要求的基質(zhì)濃度。如當基質(zhì)濃度為120 g/L時候，雖然由于高濃度基質(zhì)對酵母性能抑制而導致菌體對基質(zhì)得率和最終乙醇產(chǎn)率的下降，但仍能達近80%的乙醇產(chǎn)率，所得乙醇濃度為48 g/L，為工藝可接受范圍。

基質(zhì)濃度為160 g/L時，所得乙醇濃度為53 g/L，產(chǎn)率降至65%，酵母菌活性受到較大程度的抑制，但基質(zhì)的投加仍能提升最終產(chǎn)物濃度。而當基質(zhì)濃度大于160 g/L后，繼續(xù)增加基質(zhì)投加量，乙醇產(chǎn)率和發(fā)酵速率急劇下降，相應地，產(chǎn)物最高濃度幾乎不再增加，甚至略有減小，浪費大量原材料和時間。基質(zhì)濃度為280 g/L時，產(chǎn)率僅為40%，最終產(chǎn)物濃度為55 g/L，酵母菌的發(fā)酵性能受到了嚴重抑制。

因此，在實驗條件下160 g/L為基質(zhì)的最大投加濃度，高于該值時，酵母生長和發(fā)酵性能急劇下降，繼續(xù)增大基質(zhì)濃度對發(fā)酵已無實際意義。對于實驗酵母菌株的性能改進和發(fā)酵工藝的優(yōu)化是提高工業(yè)生產(chǎn)過程中投加最高基質(zhì)濃度及生產(chǎn)效益的有效措施。

2.2 產(chǎn)物對乙醇發(fā)酵的影響

乙醇是釀酒酵母厭氧發(fā)酵的重要產(chǎn)物，但對酵母細胞本身又是毒素和抑制劑［12］。在高濃發(fā)酵過程后期，存在著基質(zhì)和產(chǎn)物的協(xié)同抑制作用。因而在研究產(chǎn)物乙醇的單獨抑制作用時，需模擬出低基質(zhì)濃度高產(chǎn)物濃度的發(fā)酵狀態(tài)，即在低基質(zhì)濃度的初始反應條件下，額外加入不同濃度乙醇，從而得出產(chǎn)物對厭氧乙醇發(fā)酵過程中酵母菌性能的單獨抑制作用。

實驗中，設置的初始添加乙醇濃度梯度為0、10、20、30、40、50、60、70、80 g/L，基質(zhì)濃度均選為 80 g/L，發(fā)酵96 h，每隔24 h取樣。

2.2.1 產(chǎn)物對酵母菌生長抑制

圖5是不同初始乙醇濃度下酵母菌生長情況對比。

圖5 不同初始乙醇濃度下菌體濃度隨時間變化Fig.5 Variation of yeast concentration under different initial ethanol concentration

初始添加的乙醇對于酵母菌的增長具有抑制作用，在低濃度乙醇(小于30 g/L)情況下，菌體量的增幅雖隨著乙醇濃度提高緩慢減小，但最高菌體濃度對比初始濃度仍有70%以上的增長，且菌體濃度在24 h已達最大值，外源乙醇對于酵母菌增長的抑制作用不明顯;而在較高乙醇濃度(30～50 g/L)下，酵母菌的濃度最高只增長了30%左右，酵母菌的生長開始受到了較嚴重的抑制，同時酵母菌的延滯適應期也明顯增加，對于初始添加40 g/L乙醇時，酵母菌在24 h基本未增長，在48 h達最大濃度，而初始添加50 g/L乙醇時，前48 h菌體均處于停滯期，72 h才達最大濃度;繼續(xù)增高乙醇濃度，酵母菌在整個實驗時間段內(nèi)均增長非常緩慢，菌體濃度增長率均小于10%，當乙醇濃度大于70 g/L后，菌體濃度完全停止增加，甚至略有減小，酵母菌的生長繁殖由于受到了高濃度產(chǎn)物的強烈抑制作用已完全停止。

2.2.2 產(chǎn)物對酵母菌乙醇發(fā)酵性能的抑制

雖然乙醇在低濃度時對于酵母菌的生長無明顯抑制作用，但對于酵母菌葡萄糖代謝活性卻有著顯著抑制作用。由圖6不同初始濃度下葡萄糖轉(zhuǎn)化率比較可得，就最終的葡萄糖的轉(zhuǎn)化率而言，隨著乙醇添加量的增加而迅速減小:在空白對照實驗中，酵母菌96 h能夠消耗所有的葡萄糖，乙醇濃度10 g/L時，轉(zhuǎn)化率為60%;而在20 g/L時，葡萄糖轉(zhuǎn)化率進一步下降到只有30%;乙醇濃度大于70 g/L后，葡萄糖幾乎不再消耗，酵母菌對葡萄糖的代謝受到嚴重抑制。

圖6 不同初始乙醇濃度下葡萄糖轉(zhuǎn)化率比較Fig.6 Comparison of glucose consumption rate under different initial ethanol concentration

通過對比圖6和圖7可以得出，葡萄糖轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)率變化規(guī)律非常一致，酵母菌消耗的葡萄糖幾乎均有效轉(zhuǎn)化為乙醇。由此可推斷，在乙醇發(fā)酵過程中，葡萄糖的轉(zhuǎn)運和代謝是主要限制性因素，是整個發(fā)酵過程中限速步驟［13－14］，最終乙醇產(chǎn)率低下主要原因是受到上游代謝途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)化率低下所制約。因而提高糖酵解途徑及糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中關鍵酶在高乙醇濃度下的活性是加強酵母菌乙醇發(fā)酵性能的重要措施。

圖7 不同初始濃度乙醇下乙醇產(chǎn)率變化Fig.7 Comparison of ethanol yield under different initial ethanol concentration

鑒于圖5中所示不同乙醇濃度下酵母菌濃度存在較大差異，為了排除菌體濃度對乙醇發(fā)酵性能的影響，故采用單位質(zhì)量酵母菌單位時間所產(chǎn)乙醇質(zhì)量即乙醇發(fā)酵速率［15］來表征在不同乙醇濃度下的酵母菌實際發(fā)酵性能。

圖8是不同的初始乙醇濃度下乙醇發(fā)酵速率的變化曲線。

圖8 不同初始濃度乙醇下乙醇發(fā)酵速率變化Fig.8 Comparison of ethanol fermentation rate under different initial ethanol concentration

由圖8可得:(1)隨著初始乙醇濃度的提高，各時段乙醇發(fā)酵速率總體呈下降趨勢。對于各反應時間段，0～24 h發(fā)酵速率差異最大，而反應后期，由于本身乙醇發(fā)酵速率均較小，因而在不同初始乙醇濃度下發(fā)酵速率差異性較小，圖中24～48 h、48～72 h、72～96 h 3條曲線較0～24 h明顯平緩。(2)不同初始乙醇濃度下發(fā)酵速率變化也存在明顯區(qū)別。在較低初始乙醇濃度(小于30 g/L)情況下，前24 h的乙醇發(fā)酵速率顯著高于后期的乙醇發(fā)酵速率，發(fā)酵后期，由于酵母菌自身產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇疊加抑制作用，加之底物和營養(yǎng)物質(zhì)消耗，酵母菌所處系統(tǒng)環(huán)境更為惡劣;相反地，對于高濃度初始乙醇的發(fā)酵環(huán)境，整個過程中乙醇發(fā)酵速率無顯著變化，甚至部分后期發(fā)酵速率高于前期，這是由于系統(tǒng)本身的乙醇增量不明顯，并且底物和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗均很少，環(huán)境變化不大，因而逐漸適應高濃度乙醇環(huán)境的酵母菌發(fā)酵性能可保持穩(wěn)定，甚至在后期略有提升。

在模擬的高產(chǎn)物低基質(zhì)濃度發(fā)酵環(huán)境中，乙醇對酵母菌生長和發(fā)酵性能具有嚴重抑制作用，是影響最終木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)效益的重要因素。究其原因，除了嚴重抑制酵母細胞糖代謝和轉(zhuǎn)運途徑外［14］，乙醇還抑制細胞膜上ATP酶活性導致質(zhì)子濃度梯度的破壞，造成胞內(nèi)營養(yǎng)元素的流失，同時又改變細胞膜上的磷脂組分和麥角固醇含量，增加細胞膜非特異透過性，削弱其對酵母細胞的保護作用;另外乙醇還引起胞內(nèi)線粒體氧化損傷，進一步降低了酵母菌的乙醇發(fā)酵性能［16－17］。正是由于乙醇對酵母細胞多方面的毒害作用，酵母菌對乙醇非常敏感，為保持酵母菌較高生長和發(fā)酵活性，需保證發(fā)酵液中乙醇濃度小于30 g/L。當產(chǎn)物濃度大于酵母菌對外源乙醇的最大耐受濃度70 g/L后，菌體生長和發(fā)酵完全停止。設法降低產(chǎn)物的抑制作用是提升乙醇產(chǎn)率最為直接和有效的途徑。

2.2.3 內(nèi)外源乙醇抑制對比

2.2.1 和2.2.2的實驗結(jié)果證明了產(chǎn)物乙醇對于酵母菌厭氧乙醇發(fā)酵的強烈抑制作用，但模擬實驗和實際發(fā)酵結(jié)果還存在一定區(qū)別:如在基質(zhì)抑制實驗中得到酵母乙醇發(fā)酵的實際過程中，最大產(chǎn)物濃度僅55 g/L，此結(jié)果低于外源乙醇抑制實驗中所得到的最大耐受濃度70 g/L。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因除了發(fā)酵初期高濃度基質(zhì)對酵母菌乙醇發(fā)酵性能的協(xié)同抑制作用外，外源添加的乙醇與酵母菌自身發(fā)酵所產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇對于酵母菌的抑制作用的差異也有可能是重要原因，因此有必要系統(tǒng)對比相同濃度下內(nèi)源和外源乙醇對于酵母發(fā)酵的抑制作用。

設置的外源乙醇濃度為 10、20、30、40、50、60、70、80 g/L，只測定不同外源乙醇濃度下0 h，12 h的酵母菌濃度、葡萄糖濃度和乙醇濃度，以排除后期酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇抑制作用的干擾;內(nèi)源乙醇抑制對比實驗取樣時間為每隔12 h，共96 h，初始不添加乙醇，其余實驗及檢測條件保持完全一致不采用。

內(nèi)外源乙醇濃度酵母菌比增長速率的對比情況同見圖9。當乙醇濃度小于15 g/L時，內(nèi)外源乙醇對于酵母菌的生長抑制作用沒有明顯區(qū)別;乙醇濃度大于15 g/L時，與外源乙醇環(huán)境相比較，在內(nèi)源乙醇環(huán)境中的酵母菌比增長速率減小幅度明顯加劇。在28 g/L內(nèi)源乙醇下，菌體比增長速率已降為零，而對于外源乙醇，酵母菌耐受濃度達70 g/L，高濃度情況下內(nèi)源乙醇對于酵母菌生長的抑制作用顯著大于外源乙醇。

圖9 內(nèi)外源乙醇下12h酵母菌平均比增長速率對比圖Fig.9 Comparison of 12 h-averaged specific yeast growth rate under endogenous and exogenous ethanol

圖9內(nèi)外源乙醇作用下乙醇發(fā)酵速率的對比曲線見圖10。在相同濃度下，內(nèi)源乙醇作用下酵母菌乙醇發(fā)酵速率均低于外源乙醇作用下的發(fā)酵速率，即酵母菌對內(nèi)源乙醇更為敏感，如當乙醇濃度為38 g/L時，內(nèi)源乙醇下發(fā)酵速率已經(jīng)很低，僅為0.005 g乙醇/(g酵母菌·h)，而外源乙醇下發(fā)酵速率仍大于0.200 g乙醇/(g酵母菌·h)。由圖10可得，就乙醇發(fā)酵速率隨乙醇濃度的衰減規(guī)律，外源乙醇下呈線性衰減，而內(nèi)源乙醇時則為高次冪衰減［18］。

圖10 內(nèi)外源乙醇下12 h乙醇平均發(fā)酵速率對比圖Fig.10 Comparison of 12 h-averaged ethanol fermentation rate under endogenous and exogenous ethanol

在對比實驗中，所選基質(zhì)濃度為80 g/L，而綜合先前的實驗結(jié)果，當反應的基質(zhì)濃度更高時，由于酵母菌對高濃發(fā)酵環(huán)境的逐漸適應，其乙醇耐受濃度有所增加，所以酵母菌發(fā)酵對內(nèi)源乙醇最大耐受濃度為2.1所述實際發(fā)酵中所獲得的最高產(chǎn)物濃度55 g/L。

綜上所述，無論對酵母菌的增長抑或發(fā)酵性能，內(nèi)源乙醇的抑制作用均大于外源乙醇的抑制作用。分析原因，主要由于發(fā)酵過程中乙醇向細胞外散速率有限，導致酵母細胞內(nèi)乙醇濃度高于胞外［19］，而細胞內(nèi)部高濃度乙醇的長時間積累以及向胞外的持續(xù)滲透不斷抑制著酵母細胞的生理活性，其影響程度大于高濃度外源乙醇對酵母菌的沖擊。另外，由于細胞膜的保護作用，減緩降低了外源乙醇向細胞內(nèi)的滲透和毒害作用，減小及延緩了乙醇對細胞內(nèi)酶活及胞內(nèi)器官的損害。所以，若在產(chǎn)物乙醇累計至高濃度后才提取，可能對于恢復酵母活性以提高最終乙醇發(fā)酵效率作用不大，因為胞內(nèi)高濃度乙醇的積累及向外滲透過程已經(jīng)造成了酵母細胞不可逆破壞;而若通過循壞氣提、真空提取法等發(fā)酵提取耦合技術，始終將乙醇維持在較低濃度，雖可以有效減小產(chǎn)物對酵母菌的抑制作用［20－21］，卻對工藝提出更高要求，亦進一步增加生產(chǎn)成本，需要對兩者作出權衡。

在實際發(fā)酵過程中的高濃度內(nèi)源乙醇環(huán)境下，酵母菌的生長和發(fā)酵均受到了更嚴重的抑制，酵母菌的最大耐受濃度小于70 g/L，所以在高產(chǎn)物濃度下，提高酵母菌的生長及發(fā)酵活性對于保證最終的高乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)效益顯得更為重要。

2.3 高濃發(fā)酵中酵母菌性能關鍵指標

通過以上實驗，定量表述了高濃發(fā)酵中酵母菌Saccharomyces cerevisiae BY4742在不同基質(zhì)和產(chǎn)物濃度下生長及發(fā)酵活性的變化情況，并得出了實驗酵母菌的性能關鍵指標，即其對基質(zhì)和產(chǎn)物的耐受濃度。詳見表1。

表1 Saccharomyces cerevisiae BY4742發(fā)酵關鍵濃度指標Table 1 Key concentrations index for Saccharomyces cerevisiae BY4742

3 總結(jié)與展望

本文以燃料乙醇生產(chǎn)環(huán)節(jié)中重要的發(fā)酵步驟為研究對象，探索了基質(zhì)和產(chǎn)物對厭氧乙醇發(fā)酵過程中酵母生長及發(fā)酵性能的抑制作用，確定了基質(zhì)對酵母菌性能抑制的臨界濃度值以及酵母菌所能耐受的最大產(chǎn)物濃度，同時比較了內(nèi)源和外源乙醇對酵母菌抑制程度的差異，所得結(jié)論如下:

(1)酵母菌乙醇發(fā)酵的最佳基質(zhì)濃度為80 g/L，乙醇產(chǎn)率可達94%。繼續(xù)提高基質(zhì)濃度，雖然乙醇產(chǎn)率有所下降，但仍能達到80%，且發(fā)酵所產(chǎn)乙醇濃度也不斷增加，可至55 g/L;當基質(zhì)濃度大于臨界值160 g/L后，由于受到高濃度基質(zhì)的顯著抑制作用，產(chǎn)率降至65%以下，且最終發(fā)酵所得乙醇濃度和最終菌體濃度都幾乎不再增加，甚至略有減小，基質(zhì)濃度繼續(xù)提高對于乙醇發(fā)酵已無實際意義。

(2)產(chǎn)物乙醇對于酵母菌的生長和發(fā)酵性能具有顯著抑制作用，是高濃發(fā)酵過程中制約乙醇產(chǎn)量的重要因素。

(3)內(nèi)源乙醇對酵母菌生長及乙醇發(fā)酵性能的抑制作用均大于外源乙醇。單就乙醇發(fā)酵而言，酵母菌對于外源乙醇的最大耐受濃度為70 g/L，對內(nèi)源乙醇該濃度則為55 g/L。所以，設法保證酵母菌在高濃度產(chǎn)物下的活性是提高乙醇總產(chǎn)量進而推廣木質(zhì)纖維素制乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的最為直接和關鍵措施。

對于減弱乙醇的抑制作用、提高酵母活性，還可從以下幾方面進行:

(1)篩選、馴化或通過基因工程改造酵母菌，取得高乙醇耐受性酵母菌株，保證其仍能在高濃度乙醇環(huán)境中保持較高活性，以減小乙醇抑制作用。

(2)反應進程中及時添加酵母所需微量元素及其他營養(yǎng)物質(zhì)，以彌補反應中營養(yǎng)物質(zhì)流失及消耗而導致的酵母活性降低的問題。

(3)反應至一定進程后，及時提取發(fā)酵液中乙醇，同時添加少量高活性新鮮酵母，以達到降低最終殘?zhí)菨舛?、提高乙醇產(chǎn)率之目的。

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