寧宇　李蕾　苗永美　李季　陳勁楓

摘 要： 以黃瓜品種長(zhǎng)春密刺子葉節(jié)為外植體，研究了乙酰丁香酮（AS）的添加方式、濃度及共培養(yǎng)pH對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明：在侵染菌液和共培養(yǎng)基中加入AS均可顯著提高黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率，濃度以100 μmol·L-1為最佳。共培養(yǎng)基的pH 對(duì)黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率也有影響，其中在pH 5.2的共培養(yǎng)基上黃瓜轉(zhuǎn)化率最高。研究結(jié)果優(yōu)化了黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高了黃瓜轉(zhuǎn)化效率，為推動(dòng)黃瓜轉(zhuǎn)基因工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 黃瓜； 遺傳轉(zhuǎn)化； 乙酰丁香酮； pH

黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全世界范圍內(nèi)有較大的種植面積。黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源較少，很多重要的遺傳性狀無法通過有性雜交的手段來改良。因此，基因工程技術(shù)就成為對(duì)常規(guī)育種的有效補(bǔ)充手段。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)法是黃瓜轉(zhuǎn)基因中最為常用的方法[1]，目前已通過這種方法將iaaM[2]、BnCS[3]及opd[4]等基因轉(zhuǎn)入到黃瓜當(dāng)中。但目前這種方法應(yīng)用的最大瓶頸是黃瓜的再生困難、轉(zhuǎn)化效率低，因此如何提高黃瓜的轉(zhuǎn)化率，建立穩(wěn)定、高效的轉(zhuǎn)化體系是黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程中急需解決的問題。

乙酰丁香酮（AS）是宿主細(xì)胞分泌出的一種酚類化合物，它可以通過增強(qiáng)農(nóng)桿菌的侵染效果來提高基因的轉(zhuǎn)化效率。目前在水稻[5]、辣椒[6]及楊樹[7]等多種作物的基因轉(zhuǎn)化過程中都會(huì)添加一定濃度的AS來提高轉(zhuǎn)化效率。AS的作用效果受多種因素的影響，如植物種類、AS的添加方式和濃度、菌株和載體類型、共培養(yǎng)pH及對(duì)AS產(chǎn)生協(xié)同作用的物質(zhì)等[8]。其中AS的添加方式和濃度及共培養(yǎng)pH是較為重要的3個(gè)因素，探討這三者對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)化率的影響對(duì)于優(yōu)化黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系具有十分重要的意義，而目前這方面的研究還未見報(bào)道。

本文以黃瓜品種長(zhǎng)春密刺為試材，就AS的添加方式、濃度及共培養(yǎng)pH對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行了探討，以明確AS在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程中的使用條件和方法及最佳共培養(yǎng)pH，建立穩(wěn)定、高效的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，為提高黃瓜轉(zhuǎn)化效率、推動(dòng)黃瓜轉(zhuǎn)基因工作的前進(jìn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室保存的華北型黃瓜長(zhǎng)春密刺的高代自交系。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105（Rif R，Kan R），由本實(shí)驗(yàn)室保存和提供。植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-CsCBF3由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，載體上攜帶標(biāo)記基因HYG（潮霉素）、目的基因CsCBF3[9]、GUS基因、GFP基因，CaMV35S啟動(dòng)子及NOS終止子，圖譜如圖1所示。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-CsCBF3的

T-DNA區(qū)圖譜

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌-子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化黃瓜 試驗(yàn)于2012年3月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。選取飽滿的長(zhǎng)春密刺種子，在0.1% 的升汞溶液中消毒滅菌8 min，無菌水沖洗4～6次后用濾紙吸干表面水分，然后接種在MS培養(yǎng)基上。（25±2）℃ 條件下暗培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)至光下繼續(xù)培養(yǎng)，4～5 d后切取子葉節(jié)，接種在預(yù)培養(yǎng)基上黑暗中預(yù)培養(yǎng)2 d。

挑取攜帶表達(dá)載體pCAMBIA1304-CsCBF3的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于YEB+50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)16 h。離心后棄去上清液，加入MS0液體培養(yǎng)基重懸至OD600為0.6作為侵染液。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃瓜子葉節(jié)置于MS0農(nóng)桿菌菌液中侵染10 min，吸干菌液后接種在共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基上，每2周繼代培養(yǎng)1次。

1.2.2 乙酰丁香酮處理 1）侵染菌液中加入乙酰丁香酮：在MS0農(nóng)桿菌菌液中加入乙酰丁香酮，使終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1，低速震蕩培養(yǎng)1 h以活化農(nóng)桿菌，然后將其作為侵染菌液用于侵染，每處理3次重復(fù)。2）共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮：試驗(yàn)采取兩因素正交設(shè)計(jì)，將共培養(yǎng)基pH分別設(shè)為4.9、5.2、5.5、5.8，在每個(gè)pH水平上分別添加乙酰丁香酮至終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1，以未添加AS的MS0農(nóng)桿菌菌液為侵染液，每處理3次重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 抗性芽在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代2～3次（選擇培養(yǎng)30 d）后統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)芽外植體數(shù)與總外植體數(shù)。將抗性芽誘導(dǎo)率（用產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)與總外植體數(shù)的比值的百分率表示）作為評(píng)價(jià)黃瓜轉(zhuǎn)化率的指標(biāo)。利用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算及顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 侵染菌液中添加AS對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)化效率的影響

將預(yù)培養(yǎng)2 d的黃瓜子葉節(jié)浸至于添加了不同濃度乙酰丁香酮的菌液當(dāng)中侵染，侵染后先在共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，然后接種在選擇培養(yǎng)基上篩選，30 d后統(tǒng)計(jì)抗性芽誘導(dǎo)率。結(jié)果表明（表1），與對(duì)照相比，侵染菌液中添加AS可顯著的提高黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率。隨著其濃度的增加，抗性芽誘導(dǎo)率也隨之升高，濃度為100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最高。若AS濃度繼續(xù)增加，誘導(dǎo)率反而下降。說明在侵染菌液中加入AS可有效提高黃瓜的轉(zhuǎn)化率，但濃度不宜過高，以100 μmol·L-1為最佳。

表1 菌液中添加乙酰丁香酮對(duì)

抗性芽誘導(dǎo)率的影響

[注] 大寫字母表示差異極顯著（P<0.01），小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同。

2.2 共培養(yǎng)基中不同AS濃度與pH組合對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)化效率的影響

將預(yù)培養(yǎng)2 d的黃瓜子葉節(jié)浸至于未添加乙酰丁香酮的菌液中侵染，侵染后接種在不同濃度AS和pH組合的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)總外植體數(shù)和長(zhǎng)芽外植體數(shù)，計(jì)算抗性芽誘導(dǎo)率（表2）。結(jié)果表明，不同濃度的AS和不同共培養(yǎng)基pH的配合使用對(duì)黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率有顯著影響。在不同的組合當(dāng)中，在不添加AS的pH為4.9或5.8的共培養(yǎng)基上獲得的抗性芽誘導(dǎo)率最低，均為13.33%。而在pH為5.2的共培養(yǎng)基上添加100 μmol·L-1的AS時(shí)獲得的黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到44%，因此，該組合可作為黃瓜轉(zhuǎn)化過程中最適的共培養(yǎng)條件。

2.3 共培養(yǎng)基中AS濃度對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)化效率的影響

從表3可以看出，乙酰丁香酮濃度單因素的F值達(dá)到了極顯著的水平，說明共培養(yǎng)階段AS濃度對(duì)黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率有極大的影響，因此本研究將其作為主效應(yīng)因子就其對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律進(jìn)行了分析。結(jié)果表明（表4），與不添加AS的對(duì)照相比，共培養(yǎng)基中添加AS可顯著提高黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率。在本研究所設(shè)的AS濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率也不斷升高，并且在濃度為100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最大，為38.05%。但隨著AS濃度繼續(xù)升高，誘導(dǎo)率反而降低，原因可能是AS配制時(shí)一般使用二甲基亞砜（DMSO）溶解，而二甲基亞砜有劇毒，濃度過高抑制了農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

表4 共培養(yǎng)基中乙酰丁香酮濃度對(duì)

抗性芽誘導(dǎo)的影響

2.4 共培養(yǎng)pH對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)化效率的影響

共培養(yǎng) pH 的高低也會(huì)影響農(nóng)桿菌的侵染效果，為探索黃瓜轉(zhuǎn)化過程中最適的共培養(yǎng)pH，將其作為主效應(yīng)因子對(duì)其進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表5），不同共培養(yǎng)pH條件得到的黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率不同。當(dāng)pH為5.8時(shí)，黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率最低，僅為22.59%。而pH為5.2時(shí)黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率最高，為31.65%，但與共培養(yǎng)pH為5.5時(shí)的誘導(dǎo)率差異并不顯著。因此可得出結(jié)論，pH為5.2～5.5的共培養(yǎng)基較適宜黃瓜轉(zhuǎn)化。

3 討 論

乙酰丁香酮是一種酚類化合物，其主要作用機(jī)理是通過誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化和表達(dá)，將T-DNA區(qū)從T兩側(cè)25 bp邊緣序列中切割下來，促進(jìn)了DNA的轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌T-DNA更易進(jìn)入植物基因組并與其整合[10]。根據(jù)乙酰丁香酮的作用機(jī)理在使用過程中一般分為菌液中添加、共培養(yǎng)基中添加以及在菌液和共培養(yǎng)基中共同添加3種方法，如在藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)在根癌農(nóng)桿菌菌液中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮，可使轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)率從5.76%提高到12.1%[11]；在研究杉木轉(zhuǎn)基因時(shí)，在共培養(yǎng)基中加入80 μmol·L-1乙酰丁香酮，Kan抗性芽的產(chǎn)生頻率比對(duì)照有了明顯提高[12]。當(dāng)然，還有一些其他有效利用乙酰丁香酮的方法，如在甘薯外植體傷口處滴加乙酰丁香酮也可顯著提高抗性芽獲得率[13]。本研究分別在侵染菌液和共培養(yǎng)基中添加了一定濃度的乙酰丁香酮，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，這2種方法均可顯著提高黃瓜抗性芽的誘導(dǎo)率。

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，不同物種的最適乙酰丁香酮濃度也不盡相同。在黃柏遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)加入60 μmol·L-1乙酰丁香酮轉(zhuǎn)化率最高[14]，向日葵遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)基中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮最有利于提高轉(zhuǎn)化率[15]，而丹參遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的最適濃度為400 μmol·L-1[16]。本文對(duì)黃瓜最適的乙酰丁香酮濃度進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)加入100 μmol·L-1的乙酰丁香酮可大幅提高黃瓜抗性芽的誘導(dǎo)率。

pH值的高低對(duì)乙酰丁香酮的誘導(dǎo)效果也有著明顯的影響，從理論上講，含乙酰丁香酮的培養(yǎng)基pH為5.0～5.5時(shí)，乙酰丁香酮的誘導(dǎo)效果較好。前人研究表明[17]，乙酰丁香酮在pH值5.2的條件下轉(zhuǎn)化效果最好。本文研究了pH值對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明共培養(yǎng)pH 5.2時(shí)黃瓜的抗性芽誘導(dǎo)率最高，但其對(duì)于黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率影響并不顯著。

本文對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程中乙酰丁香酮的使用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，進(jìn)一步優(yōu)化了黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為推動(dòng)黃瓜轉(zhuǎn)基因工作的前進(jìn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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