劉暢　封昀　朱柏政等

研究背景

高一時，班里一名同學(xué)吃零食后，全身皮膚上出現(xiàn)許多紅色小硬塊，眼瞼腫脹，并伴有哮喘，被同學(xué)們緊急送往醫(yī)院搶救。熱心的醫(yī)生告訴我們，這是食物過敏，與攝取食物中含有異源蛋白有關(guān)。在上生物課時，我們也了解到目前世界范圍內(nèi)基因工程方興未艾，其中Bar基因是使用較多的基因之一。轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)進(jìn)入市場和餐廳。這名同學(xué)的過敏是不是與吃了轉(zhuǎn)基因食品有關(guān)呢？轉(zhuǎn)Bar基因稻米是否會引起食物過敏呢？稻米中Bar基因表達(dá)的產(chǎn)物是否會成為過敏原？轉(zhuǎn)Bar基因稻米是否會對人體健康產(chǎn)生影響？心底的疑問激發(fā)了我們探究的興趣。

材料與方法

材料、儀器

◇小鼠養(yǎng)殖房由2間生物實(shí)驗(yàn)室改建而成，1間作為飼養(yǎng)室，1間作為消毒、解剖、器材室。養(yǎng)殖房內(nèi)配空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)、消毒滅菌系統(tǒng)、照明紫外燈系統(tǒng)、純凈水設(shè)備、通訊設(shè)備、小鼠養(yǎng)殖籠具等。

◇稻米：轉(zhuǎn)Bar基因稻谷“香兩優(yōu)681（香125S/Bar68-1）”和常規(guī)稻谷“香兩優(yōu)68（香125S/D68）”，分別加工成大米。

◇基礎(chǔ)飼料：為滿足蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量，選用1993年美國營養(yǎng)學(xué)會推出的適用于嚙齒動物的AIN-93G飼料配方為參照標(biāo)準(zhǔn)配制而成。

◇小鼠日糧由稻米、小麥、豆粕、魚粉、花生油、磷酸氫鈣、預(yù)混料等組成，每日飼喂2次。

◇實(shí)驗(yàn)動物：SPF級昆明小鼠200只，體重18～24g。

◇主要儀器：全自動血液分析儀（Sysmex XT-18001）、高速冷凍離心機(jī)（TCL-16A）。

◇主要試劑：slgA、DAO、IgEELISA定量測定試劑盒，孕激素放射免疫試劑盒，PAT ELISA檢測試劑盒（型號AP013）。

實(shí)驗(yàn)假設(shè)、思路、方法

◇實(shí)驗(yàn)假設(shè)。轉(zhuǎn)Bar基因稻米中的PAT可能成為腸道中的過敏原：小鼠食用轉(zhuǎn)Bar基因稻米后，由該基因表達(dá)的PAT進(jìn)入其腸道成為異源蛋白，可能成為過敏原。

哺乳動物妊娠的特殊生理：妊娠階段母鼠攝入致敏物質(zhì)后，自身及胎兒所受的影響將比普通鼠顯著。通過小鼠連續(xù)3代、大劑量（飼料中分別含40g或60g轉(zhuǎn)Bar基因大米）飼喂后，預(yù)期妊娠15天時小鼠的血常規(guī)、生化免疫指標(biāo)、孕激素含量等可能發(fā)生異常。受轉(zhuǎn)基因食物成分的影響，與對照組相比孕鼠的體重和生殖力等可能發(fā)生改變。

◇實(shí)驗(yàn)思路見圖1。

◇實(shí)驗(yàn)方法包括小鼠喂養(yǎng)、對孕鼠生殖力的影響實(shí)驗(yàn)、血樣采集、血細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量及血生化指標(biāo)測定、腸黏液slgA檢測、血清DAO和IgE檢測、血液孕激素含量檢測，以及蛋白質(zhì)的提取和檢測等。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件包整理，再使用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析、多重比較、T-檢驗(yàn)等處理。采用α=0.05為假設(shè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分析同代小鼠各統(tǒng)計(jì)量之間、喂養(yǎng)同種飼料的不同代小鼠之間有無差異。

實(shí)驗(yàn)分別針對親代孕鼠、F₁和F₂代的孕鼠進(jìn)行健康分析。分析包括行為學(xué)觀察、體重變化觀察、對生殖力的影響、血細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量與血生化指標(biāo)的組間比較、生化免疫指標(biāo)比較、血液孕激素含量測定、稻米及小鼠器官中外源蛋白的檢測以及消化道外源蛋白殘留情況檢測。

小結(jié)與討論

喂養(yǎng)轉(zhuǎn)Bar基因稻米的孕鼠行為、體重?zé)o明顯異常

以不同含量的轉(zhuǎn)Bar基因稻米喂養(yǎng)的3代孕鼠與對照組相比較，妊娠前、妊娠期間、孕鼠分娩后、哺乳期間也未見異常行為的發(fā)生。親代、F₁、F₂代妊娠小鼠體重增長規(guī)律基本一致，各組之間無顯著性差異（P>0.05）。

喂養(yǎng)轉(zhuǎn)Bar基因稻米對孕鼠的生殖力有一定影響

妊娠、分娩是每一個雌性動物繁殖下一代必須經(jīng)歷的過程。在這個過程中，雌性動物的生殖力，包括妊娠率、活胎率、流產(chǎn)率等將直接反應(yīng)出一個雌性動物繁衍后代的能力。外界環(huán)境的變化、食物成分的變化、動物自身的心理變化等產(chǎn)生的影響都可能引起動物生殖力的改變。本研究中供試的3代孕鼠，總體上表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因組的妊娠率、活胎數(shù)高于對照組，流產(chǎn)率低于對照組，這一趨勢在親代“60%轉(zhuǎn)”表現(xiàn)尤為明顯，通過檢測對應(yīng)的孕激素水平，結(jié)果能印證這一趨勢。說明轉(zhuǎn)Bar基因稻米對孕鼠的生殖力有一定影響，尤其是最初接觸轉(zhuǎn)基因水稻的親代。隨著多代遺傳，小鼠的適應(yīng)性增強(qiáng)，各項(xiàng)指標(biāo)逐漸接近對照組。因此我們認(rèn)為孕鼠的生殖力在一定程度的上升，是小鼠適應(yīng)新的食物成分的一種生存策略。

喂養(yǎng)轉(zhuǎn)Bar基因稻米后血常規(guī)指標(biāo)的差異性未達(dá)顯著性水平

本實(shí)驗(yàn)對3代妊娠小鼠（P、F₁和F₂）的紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類觀察，并對血紅蛋白等血常規(guī)項(xiàng)目進(jìn)行了逐代檢測，結(jié)果顯示食用轉(zhuǎn)Bar基因稻米的妊娠小鼠血常規(guī)8項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的改變，尤其在親代表現(xiàn)較為突出，而F₂代逐漸接近對照組；但各項(xiàng)指標(biāo)值均未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平（P>0.05）。我們認(rèn)為這可能與Bar基因表達(dá)的PAT進(jìn)入腸道成為過敏原，導(dǎo)致親代機(jī)體反應(yīng)較明顯、子代免疫能力逐漸提高有關(guān)。

小鼠生理生化免疫指標(biāo)組間、代間比較均有變化

分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、二胺氧化酶（DAO）、免疫球蛋白E（IgE）：在各代的組間比較均表現(xiàn)為“轉(zhuǎn)”完全高于“?！焙汀瓣帯?；在代間“40%轉(zhuǎn)”、“60%轉(zhuǎn)”均表現(xiàn)為F₂>F₁>親代，但未達(dá)到顯著性差異水平，原因可能是小鼠對Bar基因表達(dá)產(chǎn)物（PAT）有降解、排泄作用以及自身免疫恢復(fù)能力。而檢測中轉(zhuǎn)基因組sIgA、DAO、IgE升高，我們認(rèn)為這可能與Bar基因表達(dá)的PAT對小鼠腸道黏膜及免疫屏障系統(tǒng)造成一定損害有關(guān)；但各項(xiàng)指標(biāo)值尚未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平（P>0.05）。同時在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)₁或F₂妊娠鼠的這些指標(biāo)又恢復(fù)到與陰性組相當(dāng)?shù)姆秶?，這說明小鼠經(jīng)1～2代已開始適應(yīng)轉(zhuǎn)Bar基因食物，自動修復(fù)能力增強(qiáng)，且F₂較F₂更強(qiáng)。免疫力在一定程度上的升高，也是小鼠適應(yīng)新的食物成分的一種生存策略。

外源蛋白PAT在孕鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)殘留或生物富集現(xiàn)象

隨機(jī)抽取轉(zhuǎn)Bar基因稻米（Bar68-1）用ELISA試劑盒進(jìn)行PAT檢測，均能檢測到PAT蛋白，且ELISA顯色反應(yīng)與常規(guī)稻米（D68）差異十分明顯。說明Bar基因在稻米中有一定表達(dá)。但以轉(zhuǎn)Bar基因稻米喂食小鼠后，PAT可被機(jī)體降解、排泄，卻未發(fā)現(xiàn)殘留或生物富集現(xiàn)象。這主要是由于飼料中的蛋白質(zhì)進(jìn)入消化道后，在胃中的降解程度不高，經(jīng)過胃中酸性環(huán)境和胰腺及腸道上皮細(xì)胞分泌的各種酶作用下被降解成小的片段；而外源蛋白在胃腸道黏液中無耐受性，也會很快降解，轉(zhuǎn)基因成分沒有在小鼠體內(nèi)殘留或發(fā)生轉(zhuǎn)移，其Bar基因所表達(dá)的外源蛋白能被動物機(jī)體充分降解、排泄，不會出現(xiàn)生物富集現(xiàn)象，不會通過糞便排泄到土壤中而對環(huán)境產(chǎn)生危害。

建議

◇盡管在本實(shí)驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bar基因稻米對孕鼠產(chǎn)生明顯影響，但推廣轉(zhuǎn)基因水稻時還是要慎重行事。

◇各地應(yīng)保留一定數(shù)量的不種植任何轉(zhuǎn)基因植物的基本農(nóng)田。

◇轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)嚴(yán)格標(biāo)示。

創(chuàng)新點(diǎn)

◇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bar基因表達(dá)物能使小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

◇實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Bar基因表達(dá)物能在傳代過程中激活下一代的免疫力，且F，孕鼠免疫恢復(fù)能力高于其他2代。

◇飼喂轉(zhuǎn)Bar基因稻米的孕鼠在實(shí)驗(yàn)條件下趨向于選擇提高生殖力、免疫力的生存策略。

下一步工作打算

由于受實(shí)驗(yàn)時間、實(shí)驗(yàn)鼠數(shù)量和傳代代數(shù)的限制，實(shí)驗(yàn)中還有許多尚待完善的地方。下一步我們打算對轉(zhuǎn)基因食物中其他成分進(jìn)行過敏原測定或污染物測定；對實(shí)驗(yàn)中血常規(guī)、生化免疫、生殖力等指標(biāo)的變化是個體還是群體現(xiàn)象、變化幅度有多大等問題進(jìn)行深入探究。