葉選怡等

摘要：為了探討液體和固體發(fā)酵條件對亮菌（Armillariella tabescens）產(chǎn)漆酶的影響，采用正交試驗對亮菌液體和固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選。供試亮菌在液體培養(yǎng)時產(chǎn)漆酶甚微，在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后最高酶活為7.92 U/mL；固體發(fā)酵時在以葡萄糖濃度0.6%、稻草麥麩質(zhì)量比3∶7、溫度27 ℃、含水量65%、接種量11 mL/100 g培養(yǎng)時漆酶酶活可達(dá)3 496.7 U/g。固體發(fā)酵的酶活顯著高于液體發(fā)酵，固體發(fā)酵更適宜亮菌產(chǎn)漆酶。

關(guān)鍵詞：亮菌（Armillariella tabescens）；漆酶；液體發(fā)酵；固體發(fā)酵

中圖分類號：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1410-05

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，與抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白和胞外膽紅素氧化酶同屬于銅藍(lán)氧化酶（Blue multicupper oxidase）家族[1，2]。1883年，日本學(xué)者吉田（Yoshida）[3]首次從日本漆樹（Rhus verniciflua）樹汁中發(fā)現(xiàn)了一種可以使樹漆迅速氧化、硬化的酶；1894年，這種酶被分離純化，并被命名為漆酶[4]。多年來的研究證明，漆酶在自然界中分布于多種植物、真菌、少數(shù)昆蟲和細(xì)菌中，尤其在白腐真菌系統(tǒng)中分布更為廣泛，現(xiàn)已成為研究的熱點。漆酶具有的獨特功能使其具有巨大的生物利用潛能，如紙漿的去木質(zhì)化、染料脫色、廢水脫毒、食品加工和制藥等[5]。

亮菌（Armillariella tabescens）又名假蜜環(huán)菌，因由柳樹發(fā)光朽木分離出菌種，菌絲體在暗處有熒光，故稱亮菌[6]。亮菌中含有亮菌甲素、乙素、丙素、氨基酸、多糖等多種化學(xué)成分。民間用亮菌治療膽囊炎和傳染性肝炎有顯著效果，現(xiàn)代藥理研究表明亮菌具有醒酒[7]、保肝[8]、防輻射[9]、增強免疫[10]和抗腫瘤[11]等多種功效。為此，在前期工作的基礎(chǔ)上，以漆酶酶活為檢測指標(biāo)，對亮菌液體發(fā)酵和固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的條件進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 亮菌（Armillariella tabescens）菌種由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，培養(yǎng)保存于浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校實驗室。

1.1.2 主要試劑 ABTS[2，2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽]購自美國Sigma公司，愈創(chuàng)木酚購自上海晶純試劑有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 TU-1810SPC型紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司，Biofuge Stratos冷凍離心機(jī)購自德國賀利氏公司，PHS-3C型pH計購自上海精科儀器有限公司，BCM-1000型生物凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，SPX智能型生化培養(yǎng)箱購自寧波江南儀器廠，BS124S型電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，HH-2型恒溫水浴鍋購自國華電器有限公司，BSD-226SK型冰箱購自青島海爾股份有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 綜合PDA固體培養(yǎng)基（%）：葡萄糖2.0、瓊脂粉1.8、土豆汁20、MgSO4·7H2O 0.15、KH2PO4 0.3、VB1 0.005；液體種子培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO4 5 g、玉米粉20 g、pH 6.0；液體發(fā)酵正交試驗培養(yǎng)基（1 L）[12]：小分子碳源、高分子碳源、無機(jī)氮源、有機(jī)氮源、CaCl2 1 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1 g、VB1 0.05 g、吐溫-80 0.5 mL、微量元素8 mL、pH 6.0；液體發(fā)酵培養(yǎng)基微量元素（1L）：MnSO4·2H2O 0.5 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4·5H2O 0.1 g、H3BO3 0.01 g；固體發(fā)酵正交試驗培養(yǎng)基（%）：葡萄糖、碳源、氮源、水、（NH4）2SO4 0.5、CuSO4 0.03、CaCl2 0.47、KH2PO4 0.5、MgSO4 0.2、 VB1 0.005、pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1）斜面及平皿菌種培養(yǎng)。在無菌條件下接種斜面和平皿培養(yǎng)基，于26 ℃避光培養(yǎng)7 d，于4 ℃冰箱保存，備用。

2）種子液培養(yǎng)條件。250 mL三角瓶裝100 mL種子液培養(yǎng)基，在無菌條件下用打孔器（直徑0.5 cm）量取2塊平皿培養(yǎng)基的菌絲塊接種至種子液中，置于27 ℃搖床以120 r/min避光培養(yǎng)7 d。

3）液體發(fā)酵培養(yǎng)條件。將種子液按6%的體積比轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)條件除試驗特定其余均與種子液培養(yǎng)條件相同，所有試驗均重復(fù)3次。

4）固體發(fā)酵正交試驗培養(yǎng)條件。將種子液按一定的體積質(zhì)量比轉(zhuǎn)接，在試驗條件下避光靜置30 d。

1.2.2 粗酶液的制備

1）液體發(fā)酵酶液的制備。從液體培養(yǎng)的第8天開始，每天定時取樣2 mL，在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液。

2）固體培養(yǎng)基酶液的制備。將固體培養(yǎng)基按質(zhì)量比1∶1加入去離子水、搗碎培養(yǎng)料并攪拌均勻，放置于4 ℃冰箱中浸泡24 h，用八層紗布過濾，然后將濾液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 漆酶酶活的測定 4 mL反應(yīng)體系中含0.5 mmol/L的ABTS（反應(yīng)底物）、0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0）、1 mL稀釋的粗酶液，于35 ℃反應(yīng)5 min，在波長420 nm處測吸光度，取吸光度變化的線性部分。酶活定義：在一定條件下，每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量為一個酶活單位，單位為U。酶活=△OD420 nm×稀釋倍數(shù)×4 mL×106/（1 mL×△t×ε×1 cm）（ε為消光系數(shù)，ε=3.6×104 cm/（L·mol）。

1.2.4 亮菌產(chǎn)漆酶的液體發(fā)酵工藝

1）不同培養(yǎng)基組合對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。對不同碳源和氮源組合進(jìn)行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表1，培養(yǎng)完成后測定亮菌漆酶酶活，分析不同培養(yǎng)基組合對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。

2）不同培養(yǎng)基濃度對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。在上一步試驗得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組合基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基不同濃度進(jìn)行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表2。發(fā)酵完成后測漆酶酶活，分析不同培養(yǎng)基濃度對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。

3）不同培養(yǎng)條件對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。在優(yōu)化培養(yǎng)基前提下分別對裝液量、接種量、菌齡和培養(yǎng)時間進(jìn)行L9（34）正交試驗，試驗因素與水平見表3。發(fā)酵結(jié)束后測漆酶酶活，分析不同培養(yǎng)條件對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。

4）不同誘導(dǎo)劑對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。在以上最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行亮菌產(chǎn)漆酶誘導(dǎo)試驗。試驗設(shè)計4組，分別加入0.5 mmol/L愈創(chuàng)木酚、0.5 mmol/L吐溫-80、0.5 mmol/L苯酚、0.2 g/L CuSO4作誘導(dǎo)產(chǎn)漆酶試驗，平行試驗3組，分析不同誘導(dǎo)劑對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。

1.2.5 亮菌產(chǎn)漆酶固體發(fā)酵正交試驗 選擇葡萄糖濃度、稻草∶麥麩（m/m，下同）、溫度、含水量、接種量5個因素進(jìn)行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表4。發(fā)酵完成后測定漆酶酶活，分析不同培養(yǎng)基及發(fā)酵條件對亮菌固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 亮菌產(chǎn)漆酶液體發(fā)酵結(jié)果

2.1.1 不同培養(yǎng)基組合對亮菌產(chǎn)漆酶的影響 碳源和氮源是影響亮菌菌絲生長和代謝的重要因素，也是合成漆酶的重要原料。試驗分別以小分子碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，高分子碳源淀粉、玉米粉、麥麩，無機(jī)氮源硫酸銨、氯化銨、硝酸銨，有機(jī)氮源酵母浸膏、蛋白胨、黃豆粉組合為不同碳源和氮源，測定不同培養(yǎng)基組合對亮菌產(chǎn)漆酶的影響。試驗取第10天發(fā)酵液的酶活進(jìn)行分析，結(jié)果表明，極差為有機(jī)氮源﹥無機(jī)氮源﹥小分子碳源﹥高分子碳源，有機(jī)氮源是影響亮菌漆酶酶活的關(guān)鍵因素，其他3個因素也有一定的影響。由圖1可知，該菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最適條件組合為A1B1C1D1，即最適小分子碳源為葡萄糖，最適高分子碳源為淀粉，最適有機(jī)氮源為酵母浸膏，最適無機(jī)氮源為硫酸銨，該條件下產(chǎn)生的漆酶酶活為2.05 U/mL，較其他酶活不足1 U/mL的狀況有顯著提高。

2.1.2 不同培養(yǎng)基濃度對亮菌產(chǎn)漆酶的影響 在上一步試驗得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組合基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基不同濃度進(jìn)行正交試驗，并取第10天酶液酶活進(jìn)行極差分析。結(jié)果表明，極差為酵母浸膏濃度﹥硫酸銨濃度>葡萄糖濃度>淀粉濃度，酵母浸膏濃度是影響亮菌產(chǎn)漆酶的關(guān)鍵因素。由圖2可知，亮菌漆酶酶活最高的濃度組合是A2B2C2D2或A2B4C2D2，進(jìn)行補充試驗比較，結(jié)果表明A2B2C2D2組合酶活較高，即在濃度組合葡萄糖5 g/L、淀粉15 g/L、硫酸銨2 g/L、酵母浸膏15 g/L下，亮菌漆酶酶活達(dá)4.97 U/mL。

2.1.3 不同培養(yǎng)條件對亮菌產(chǎn)漆酶的影響 在優(yōu)化培養(yǎng)基的前提下分別對裝液量、接種量、菌齡和培養(yǎng)時間進(jìn)行正交試驗，并對其結(jié)果進(jìn)行極差分析。結(jié)果表明，極差為菌齡﹥接種量﹥培養(yǎng)時間﹥裝液量，菌齡是影響亮菌產(chǎn)漆酶最重要的因素。由圖3可知，亮菌液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最優(yōu)條件組合是A2B2C2D2，對該組合進(jìn)行補充試驗，結(jié)果表明，該組合是亮菌產(chǎn)漆酶的最優(yōu)條件組合，即在裝液量75 mL、接種量6%、菌齡7 d、培養(yǎng)時間10 d的條件下，亮菌漆酶酶活最優(yōu)，達(dá)5.35 U/mL。

2.1.4 不同誘導(dǎo)劑對亮菌產(chǎn)漆酶的影響 在前面最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行亮菌產(chǎn)漆酶誘導(dǎo)試驗，以未添加誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基作為空白對照，結(jié)果見表5。由表5可知，以愈創(chuàng)木酚為誘導(dǎo)劑時，酶活提高到1.480倍，吐溫-80和CuSO4組幾乎未變，苯酚組酶活相對減弱?？傮w上，誘導(dǎo)劑的加入使亮菌產(chǎn)漆酶并未大幅度地提高。

2.1.5 4次試驗結(jié)果的比較 將亮菌液體發(fā)酵優(yōu)化試驗依次表示為試驗1、試驗2、試驗3、試驗4，并對各步最優(yōu)漆酶酶活進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。由圖4可知，漆酶酶活隨著發(fā)酵條件的改善逐步提高，但最高酶活仍不理想。

2.2 亮菌產(chǎn)漆酶固體發(fā)酵正交試驗結(jié)果

選擇葡萄糖濃度、稻草∶麥麩、溫度、含水量、接種量5個因素進(jìn)行正交試驗，并對其結(jié)果進(jìn)行極差分析。結(jié)果表明，極差由大到小為稻草∶麥麩﹥接種量﹥含水量﹥葡萄糖濃度﹥溫度，稻草∶麥麩是影響亮菌產(chǎn)漆酶的重要因素。由圖5可知，最佳組合是A3B4C3D3E3。對該組合進(jìn)行補充試驗，結(jié)果表明，該組合是最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)漆酶組合，即葡萄糖濃度0.6%、稻草∶麥麩3∶7、溫度27 ℃、含水量65%、接種量11 mL/100 g，其他條件不變的情況下亮菌漆酶酶活可達(dá)3 496.7 U/g，比其他組合的最好酶活高出約1.7倍。

3 討論

真菌發(fā)酵篩選優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的方法很多，如單因素試驗、均勻試驗、正交設(shè)計等。由于本試驗亮菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件因素多，因素間的組合比較復(fù)雜，利用正交設(shè)計“均勻分散性和整齊可比性”的優(yōu)點，可以更準(zhǔn)確高效地篩選出最優(yōu)發(fā)酵因素和組合。

3.1 漆酶的亮菌液體發(fā)酵生產(chǎn)

微生物培養(yǎng)基碳氮源一般由小分子碳源、高分子碳源、無機(jī)氮源和有機(jī)氮源組成，因此將這4部分分別作為影響因素，既考慮到了單個碳源和氮源的影響，又考慮到了這4個因素之間不同組合的影響，可使得到的優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)更為均衡，更有利于菌種的生長代謝。其次，在最優(yōu)培養(yǎng)基組合基礎(chǔ)上依次進(jìn)行培養(yǎng)基濃度、培養(yǎng)條件正交試驗，并進(jìn)一步做了漆酶誘導(dǎo)試驗。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后亮菌漆酶酶活雖然有提高，但提高幅度很小，液體發(fā)酵所產(chǎn)漆酶的最高酶活只有7.92 U/mL，其原因可能是：①該菌本身在液體狀況下不具備良好的產(chǎn)漆酶的能力；②選擇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基不適宜，尤其表現(xiàn)在碳氮源的組合上。菌株發(fā)酵碳氮源選擇具有強大的廣泛性，本試驗選擇的碳氮源只局限在其中的幾種，可能這幾種都不是亮菌具有良好液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶能力的原料，因此還需要不斷嘗試；③碳氮比例不合適。雖然這幾種培養(yǎng)基菌體長勢不錯，但是菌體在生長階段和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生時期所需的碳氮比往往不一樣，因此，這也是今后研究的重點；④漆酶有兩種，一種是可誘導(dǎo)型漆酶，一種是組成型漆酶。在擔(dān)子菌中，細(xì)胞外組成型漆酶的生產(chǎn)量是很低的。但是各種與木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物相關(guān)的芳香烴類和酚類化合物以及重金屬都可以顯著地提高漆酶的產(chǎn)量[5]，此試驗只選了愈創(chuàng)木酚、吐溫-80、苯酚、CuSO4作為誘導(dǎo)劑，具有很大的局限性，應(yīng)加大誘導(dǎo)劑試驗范圍。

3.2 亮菌液體和固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶能力的比較

以稻草、麥麩為主料優(yōu)化亮菌固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件后，亮菌漆酶酶活達(dá)3 496.7 U/g，以其為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值計算固體發(fā)酵每克干料產(chǎn)漆酶酶活和每克干料每天產(chǎn)漆酶酶活。結(jié)果表明，每天每克干料的產(chǎn)酶效率為492.89 U/g。以同樣的方式計算亮菌液體發(fā)酵每克干料的酶活和每克干料的產(chǎn)酶效率，結(jié)果表明，每天每克干料的產(chǎn)酶效率為15.6 U/g，固體發(fā)酵的產(chǎn)酶效率是液體發(fā)酵產(chǎn)酶效率的31.6倍。本實驗室曾以麥麩∶豆餅粉為8∶2進(jìn)行培養(yǎng)，亮菌產(chǎn)漆酶酶活可達(dá)20 000 U/g左右，產(chǎn)酶效率更高[13]。綜合培養(yǎng)料的價格等因素，液體發(fā)酵成本較高。試驗結(jié)果表明固體發(fā)酵更適合亮菌產(chǎn)漆酶。

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