梁江 林昌松 林云斌

【摘 要】目的：探討斷藤益母湯含藥血清對體外培養(yǎng)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細胞增殖以及腫瘤壞死因子-α的影響和機制。方法：體外培養(yǎng)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞，取第3～5代細胞，分別加入按臨床常規(guī)口服劑量折算制取的來氟米特和斷藤益母湯家兔含藥血清，對照組加入正常家兔血清，MTT法檢測24 h、48 h、72 h后各組含藥血清對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的影響。ELISA法檢測72 h后各組細胞培養(yǎng)上清腫瘤壞死因子-α的含量。結(jié)果：相對于對照組，來氟米特和斷藤益母湯含藥血清作用48 h、72 h，二者均能顯著抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖（Ρ < 0.05），72 h后來氟米特組抑制率明顯高于斷藤益母湯（Ρ < 0.05）；相對于對照組，兩種含藥血清對腫瘤壞死因子-α也有顯著抑制作用（Ρ < 0.05），組間差異不明顯（Ρ > 0.05）；結(jié)論：成人臨床常規(guī)劑量的斷藤益母湯含藥血清作用48 h、72 h后能顯著抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖，并可降低該細胞腫瘤壞死因子-α分泌量，這可能是該方藥改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀的潛在機制之一。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；斷藤益母湯；含藥血清；滑膜成纖維細胞；腫瘤壞死因子-α；實驗研究；動物

Effects of Serum Containing Duanteng Yimu Decoction on Proliferation of Fibroblast-like Synoviocytes and TNF-α Production in Patients with Rheumatoid Arthritis

Liang Jiang，Lin Chang-song，Lin Yun-bin

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of serum containing duanteng yimu decoction （DYD） on proliferation of fibroblast-like synoviocytes （FLS） and TNF-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） production in rheumatoid arthritis patients.Methods：3 kinds of rabbits serum [normal，serum containing leflunomide （LEF），serum containing DYD] were made.RA-FLS were separated from knee joints of RA patients and subcultured for 3-5 generations.RA-FLS cells were divided into 3 groups： the control group，the LEF group （serum containing LEF） and the DYD group （serum containing DYD） and then proliferation of cells in 3 groups were evaluated by MTT at three time points （24，48，72 h）.After 72 h，cell culture medium was used to detect the TNF-α level with ELISA method.Results：Compared with the control group，after 48 h，72 h，Leflunomide and DYD serums have obviously inhibitive effects on the prolifration of RA-FLS from patients （Ρ < 0.05）.After 72 h，prolifration of RA-FLS in the LEF group was lower than the DYD group （Ρ < 0.05）.Compared with the control group，the two medicated serums have obvious inhibition on the TNF-α level （Ρ < 0.05），but with no significant difference between medicated serum groups （Ρ > 0.05）.

Conclusion：DYD can inhibit RA-FLS proliferation in conventional dose and reduce the production of TNF-α，which suggests one of the therapeutic mechanisms of DYD for RA.

【Key words】 arthritis，rheumatoid；duanteng yimu decoction；medicated serum；fibroblast-like synoviocytes；tumor necrosis factor-α；experimental study；animal

在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）病情進程中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞（RA-FLS）過度增殖，同時釋放大量諸如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致了滑膜炎和骨侵蝕的持續(xù)，因此，抑制RA-FLS增殖、降低外周血和關(guān)節(jié)液中TNF-α的含量已成為治療RA的可行方法[1]。斷藤益母湯由林昌松教授根據(jù)RA急性活動期“肝腎虧虛，風(fēng)濕瘀阻”中醫(yī)病機研制出的經(jīng)驗方，本實驗（2011年7月至2012年3月）擬觀察該方含藥血清對體外培養(yǎng)人RA-FLS增殖及其TNF-α分泌的影響。

1 實驗材料

1.1 滑膜組織來源 選取2011年在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的女性RA患者2例，均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)本獲取經(jīng)由患者及主管醫(yī)師知情同意。

1.2 藥品與試劑 斷藤益母湯（DYD）由川續(xù)斷15 g、桂林產(chǎn)昆明山海棠45 g、益母草15 g組成。所有中藥飲片均購自廣州致信藥業(yè)有限公司，水煎2 次合并藥液，3次過濾濃縮，給藥時以注射用水定容至0.6 g·mL-1；來氟米特（LEF），國藥準(zhǔn)字H31020644，批號201103，規(guī)格20 mg，購自江蘇欣凱-長征有限公司。I型膠原酶、RPM I1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清，購自美國Invitrogen公司；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）， 購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器 高速低溫離心機（LAB-Y01型，TCHLAB，廣州）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO—RAD680公司）；倒置顯微鏡（OLYMPUS-Ⅱ，日本）；CO2培養(yǎng)箱（HF90型，鄭州南北儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.4 實驗動物 雄性新西蘭大耳兔12只，5周齡，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg。動物許可證號：SCXK（粵）2008-0020。由廣東省動物實驗中心提供并飼養(yǎng)在清潔級環(huán)境中。

2 方 法

2.1 給藥干預(yù)與含藥血清的制備 按隨機數(shù)字法將受試家兔平均分為3組，并按以下方法連續(xù)灌胃7 d。DYD組：3.45 g·kg-1DYD；LEF組：1.92 mg·kg-1

LEF。（家兔給藥量均按50 kg成人常用劑量折算，其中LEF為20 mg ，每日1次，中藥按生藥量90 g，每日1次）。對照組給予15 mL生理鹽水，分早晚2次連續(xù)灌胃1周。按文獻[2]所述方法制取含藥血清：所有家兔在末次給藥1 h后心臟采血，離心取血清，56 ℃ 水浴滅活30 min，0.2 μm微孔濾器過濾，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 RA-FLS的原代培養(yǎng)與鑒定 按文獻[3]提供的組織塊法用RA滑膜組織進行RA-FLS原代培養(yǎng)：將手術(shù)取得的滑膜組織剪去脂肪組織和較大的血管，用生理鹽水漂洗3次，去除血污雜質(zhì)，剪成1 mm3碎屑后，用移液管吸附移入培養(yǎng)瓶，然后用2 mL注射器針頭將組織塊在瓶底按大約5 mm間距排布，反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，在未鋪排組織塊的一側(cè)瓶底注入培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶置入37 ℃、CO2體積濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，再次反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使貼壁的組織塊接觸培養(yǎng)液，視細胞生長情況2～5 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細胞長至融合度約70%時予傳代處理：培養(yǎng)液中加入0.25%的胰蛋白酶1 mL消化至細胞皺縮變圓時，加入培養(yǎng)液終止消化，將細胞懸液再次按1∶2分瓶培養(yǎng)，取第3～5代細胞，細胞爬片經(jīng)蘇木精-伊紅染色（HE）倒差顯微鏡鑒定純度在95%以上計為合格，用于后續(xù)試驗。

2.3 各組細胞抑制率與培養(yǎng)上清TNF-α含量的檢測 取3～5代細胞，按每孔100 uL單細胞懸液（內(nèi)含約2 000個細胞）植入96孔培養(yǎng)板，待細胞鋪滿培養(yǎng)板80%左右時，每孔更換為90 μL的RPM I1640 培養(yǎng)液，分3組干預(yù)。對照組加入10 μL正常家兔血清；LEF組加入10 μL LEF家兔血清；DYD組加入10 μL DYD家兔血清。在37 ℃、體積濃度5 % CO2培養(yǎng)箱中分3個時點培養(yǎng)（24 h、

48 h、72 h），72 h后留取各組細胞培養(yǎng)上清按ELISA試劑盒說明檢測TNF-α含量，每組6個復(fù)孔。分別于24 h、48 h、72 h后取各組細胞，加入濃度為5 mg·mL-1的噻唑藍10μL共培養(yǎng)4 h，棄上清液，加DMSO 200μL作用10 min，在設(shè)定波長為490 nm

條件下用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各組細胞吸光度值（OD值），按公式計算藥物對細胞增殖的抑制率，公式如下：抑制率%=（1-含藥血清組OD值/對照組OD值）×100%。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 RA-FLS的培養(yǎng)鑒定 在倒差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)所見如下：原代RA-FLS成長呈長纖維狀，以原組織塊所在位置（因細胞貼壁成功，原組織塊已經(jīng)移去）為中心呈射線狀向周圍輻射生長，間雜少量圓形的巨噬樣滑膜細胞；培養(yǎng)5～10 d

后，原代RA-FLS增殖與傳代速度明顯增快，巨噬樣滑膜細胞因在此培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)增殖慢，凋亡快，數(shù)目不斷減少，見圖1。第3代RA-FLS的HE染色細胞爬片顯示：第3代的RA-FLS細胞呈典型的長纖維狀或紡錘形，卵圓形細胞核位于細胞質(zhì)中間，核仁明顯較原代增大，視野內(nèi)細胞密集程度增高，巨噬樣細胞進一步減少，而RA-FLS所占比例大于95%，與文獻報道的特征相符，見圖2。

3.2 各組血清干預(yù)對RA-FLS增殖抑制情況比較（MTT法） 該實驗中OD值反映了細胞存活數(shù)量，細胞抑制率反映了血清干預(yù)對細胞增殖的抑制強度。隨著干預(yù)時間的延長，各組細胞OD值呈增長趨勢，在48 h、72 h兩個時點，兩種含藥血清組OD值均明顯低于當(dāng)時的對照組（P<0.05）；

說明干預(yù)48 h、72 h后，兩種含藥血清均能一定程度上抑制RA-FLS增殖。同一時間點不同含藥血清組間比較，24 h后，DYD組OD值明顯低于LEF組（P<0.05），提示DYD含藥血清抑制細胞增殖作用起效較LEF組迅速；48 h后，兩組OD值無明顯差異（P>0.05）；72 h后，LEF組OD值中明顯低于DYD組（P<0.05），提示

72 h末LEF含藥血清的抑制效果較DYD組更強，見表1。

3.3 72 h后RA-FLS培養(yǎng)上清TNF-α含量的情況 對照組的TNF-α含量為134.22±13.21 pg·mL-1，DYD組為108.58±12.75 pg·mL-1，LEF組為98.36±

11.76 pg·mL-1。兩種含藥血清組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量明顯低于對照組（P<0.01），但LEF組和DYD組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義

（P>0.05）。

4 討 論

RA屬中醫(yī)學(xué)“歷節(jié)”“痹病”范疇。《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》對本病病機闡釋為“寸口脈沉而細，沉即為腎，弱即為肝，汗出入水中……故曰歷節(jié)”“風(fēng)血相博，即疼痛如掣”，指明肝腎虧虛，氣血不足是其發(fā)病的內(nèi)在基礎(chǔ)，風(fēng)、寒、濕等外邪侵襲是外在誘因，作為該病病理產(chǎn)物的瘀血易與外邪纏結(jié)，痹阻經(jīng)脈使肝血、腎精不能濡養(yǎng)筋脈、骨骼，最終導(dǎo)致筋傷骨損。林昌松教授秉承前述中醫(yī)理論對RA的認(rèn)識，在長期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，嶺南地區(qū)氣候潮濕多風(fēng)，風(fēng)邪、濕邪是誘發(fā)加重RA癥狀的主要外在原因，而滑膜炎的持續(xù)與滑膜組織大量微血管彌漫性增生、充血、釋放炎癥因子密切相關(guān)，與中醫(yī)學(xué)“瘀血致病”導(dǎo)致腫痛癥狀的機制有相通之處。因此，林昌松教授將嶺南地區(qū)RA急性活動期的主要證型辨證為邪滯血瘀型，病機為“肝腎虧虛為本，風(fēng)濕瘀阻為標(biāo)”，并確立了“補肝腎、祛風(fēng)濕、散瘀血”的治法，研制出斷藤益母湯這一經(jīng)驗方。針對當(dāng)?shù)仫L(fēng)邪、濕邪偏勝，該方以桂林產(chǎn)昆明山海棠（該藥在嶺南地區(qū)民間俗稱為南蛇藤）為君藥，取其祛風(fēng)勝濕之功驅(qū)外邪；針對內(nèi)生之邪瘀血，臣藥選擇益母草以化瘀消腫利水，針對肝腎不足筋骨失養(yǎng)的虛損方面，以補肝腎壯筋骨的川續(xù)斷培補正氣，同時，兩味臣藥的配伍有補益肝腎、活血通經(jīng)以拮抗君藥生殖毒性的寓意，全方正邪兼顧，切合病機。筆者等通過70例RA急性活動期患者的隨機對照臨床試驗[4]證實，經(jīng)過12周的治療，口服DYD的試驗組與口服LEF每日20 mg

的對照組患者在DAS28評分改善方面療效相當(dāng)。體外實驗[5]證實，一定濃度的斷藤益母湯含藥血清可抑制RA-FLS增殖，其機制可能與該方含藥血清下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的Toll樣受體4的mRNA的表達、一定程度上抑制了RA-FLS的異常增殖狀態(tài)相關(guān)，但該方含藥血清是否對RA-FLS分泌的TNF-α有直接抑制作用尚不明確 。另有報道[6]川續(xù)斷的有效組分續(xù)斷皂苷具有一定程度的抗炎止痛和抗骨質(zhì)疏松作用。研究證實，自古被視為婦科活血調(diào)經(jīng)良藥的益母草組分水蘇堿有促進微動脈血流恢復(fù)、抗血小板聚集[7]的作用，可見斷藤益母湯的抗RA作用也有一定現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。

FLS是滑膜組織的主要組成部分，當(dāng)它在各種誘因下異?；罨癁镽A-FLS后，呈現(xiàn)出增生過度、凋亡不足的特征，直接導(dǎo)致滑膜增厚和血管翳的形成。同時，RA-FLS可產(chǎn)生或誘生一系列細胞因子、炎癥介質(zhì)，使病灶區(qū)滑膜組織聚集更多的炎癥相關(guān)細胞（如中性粒細胞、巨噬細胞等），維系了滑膜炎的持續(xù)以及軟骨、骨組織的進行性破壞。而TNF-α即是在RA滑膜組織細胞大量分泌的炎癥因子之一，對啟動滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損害意義重大。它可協(xié)同白介素-1通過以下4方面參與RA病理過程[8]：①增強內(nèi)皮細胞黏附分子表達，使血液中的白細胞向關(guān)節(jié)腔病灶區(qū)聚集；②刺激前列腺素等小分子炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生；③激活破骨細胞，促進糖蛋白、膠原酶降解，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞；④促進軟骨細胞和滑膜組織細胞產(chǎn)生大量白介素-6，后者有增強TNF-α和白介素-1效能的作用。此外，當(dāng)病灶區(qū)細胞（含RA-FLS）分泌TNF-α達到一定濃度（10 ng·mL-1）可導(dǎo)致RA-FLS呈現(xiàn)持續(xù)過度增殖狀態(tài)，可能與TNF-α使該RA-FLS表面具有抗細胞凋亡作用的TNFRⅡ基因表達上調(diào)相關(guān)。由此可見，RA-FLS及病灶區(qū)高濃度的TNF-α在RA復(fù)雜的細胞交互影響網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，抑制RA-FLS增殖和TNF-α的分泌是治療RA的有效措施。

有研究顯示，昆明山海棠水提取物可以抑制離體培養(yǎng)的RA-FLS增殖[4]，但水提取物的直接干預(yù)與口服藥物經(jīng)消化、吸收、代謝之后的成分可能不一致，二者對RA-FLS作用強度與起效機制是否存在差異也不明確。有效成分不清楚、藥代動力學(xué)特點難以精確量化是中藥復(fù)方實驗研究進展艱難的關(guān)鍵問題，雖然起源于日本的血清藥理學(xué)研究方法仍存在許多不足，但該方法的應(yīng)用一定程度上模擬了中藥起效的生理內(nèi)環(huán)境，為中藥復(fù)方在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究創(chuàng)造了有利條件。

本實驗制取家兔含藥血清干預(yù)第3代的人類RA-FLS，研究結(jié)果顯示，一定濃度的DYD含藥血清干預(yù)48 h即可以抑制RA-FLS的腫瘤樣增殖，48 h末作用強度與LEF相當(dāng)，72 h后抑制作用仍然存在但效果低于LEF。LEF是目前廣泛使用的治療RA常用藥，口服后在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分M1，具有明確的抑制細胞增殖作用[7]，故制取該藥含藥血清作為陽性對照組，兩種含藥血清均能抑制RA-FLS分泌TNF-α，作用強度相當(dāng)，這可能是兩藥共同的抗風(fēng)濕作用機制之一。然而，DYD含藥血清具體通過何種機制導(dǎo)致細胞增殖率降低、是否對細胞周期產(chǎn)生影響尚不明確，而兩含藥血清組TNF-α含量較對照組降低是源自細胞凋亡總體分泌量減少還是細胞分泌功能的減低也有待進一步深入研究探討。

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