閆美鳳 姜楠 徐明智 呂新亮

【摘 要】目的：觀察痹痛康丸對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6的影響，探討其治療作用機(jī)制。方法：建立II型膠原加完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組。痹痛康丸低、中、高劑量組（0.3，3，30 g·kg-1·d-1），甲氨蝶呤組（每周1.2 mg·kg-1），以上各組藥物溶解于2 mL生理鹽水中，每日1次，連續(xù)灌胃給藥4周。空白對照組及模型組灌服生理鹽水，每只2 mL。8周后處死大鼠，觀察右踝關(guān)節(jié)滑膜病理改變情況及關(guān)節(jié)滑膜中白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果：各用藥組除痹痛康丸低劑量組外，滑膜組織的病理改變均有不同程度的減輕，白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6蛋白的表達(dá)量較模型組降低（P<0.05）。結(jié)論：痹痛康丸能有效降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎程度，防止骨破壞或關(guān)節(jié)重構(gòu)，有免疫調(diào)節(jié)作用。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，膠原誘導(dǎo)性；痹痛康丸；白細(xì)胞介素-1β；白細(xì)胞介素-6；實(shí)驗(yàn)研究；大鼠

Effect of Bitongkang Pill on Interleukin-1β and Interleukin-6 in the Collagen-Induced Arthritis Rats

Yan Mei-feng，Jiang Nan，Xu Ming-zhi，Lü Xin-liang

【ABSTRACT】Objective：To investigate the impact of Bitongkang Pill on the ankle joint synovium IL-1β and IL-6 of collagen-induced arthritis （CIA） rats，exploring its therapeutic mechanism.Methods：After establishing the CIA rat models with type II collagen and complete Freund's adjuvant，60 Wistar rats were randomly divided into 6 groups：the control group，the model group，the three bitongkang pill groups [with low，medium and high dose—0.3，3，30 g （kg·d） -1] and the methotrexate group [1.2 mg （kg·w） -1].Drugs of the above groups were dissolved in physiological saline （2 mL） and the rats were continuously given drugs by intragastric administration one time per day for four weeks.Rats of the control group and the model group were given normal physiological saline，2 mL for each.After 8 weeks，the rats were sacrificed to observe the pathological changes of the right ankle joint synovium and the expression changes of the IL-1β，IL-6 proteins in synovium.Results：The pathological changes of synovial tissue of every treatment group but the group with the low-dose bitongkang pill was relieved，and the IL-1β，IL-6 protein expressions were lower than that of the model group （P < 0.05）.Conclusion：Bitongkang pill can effectively relieve the synovitis of CIA rats and prevent bone destruction or joint reconstruction，having immunomodulatory effect.

【Key words】 arthritis，collagen-induced；bitongkang pill；interleukin-1β；interleukin-6；experimental study；rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜炎癥、滲液、細(xì)胞增殖、血管翳形成，軟骨及骨組織破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和功能障礙。臨床和實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)痹痛康丸有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用，并能有效控制RA病情進(jìn)展[1，3-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究痹痛康丸對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collagen-induced Arthritis，CIA）大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中白細(xì)胞介素–1β（IL–1β）、白細(xì)胞介素–6（IL–6）蛋白表達(dá)量的影響，進(jìn)一步探討其治療RA的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級Wistar大鼠60只，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（蒙）2002-0001，雌雄各半，體質(zhì)量（190±10） g，

分籠飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑及儀器 痹痛康丸由武警內(nèi)蒙古總隊(duì)醫(yī)院制劑室提供（[2003]武制FP030001），甲氨蝶呤（MTX）（國藥準(zhǔn)字H31020644）。牛Ⅱ型膠原蛋白（c7806-10 mg，SIGMA公司生產(chǎn)，批號1000638705），弗氏完全佐劑（F5881-10 mL，SIGMA公司生產(chǎn)），鼠抗人IL-1β單克隆抗體（批號DZE90065，購于北京博奧森公司），鼠抗人IL-6免疫組化單克隆抗體（批號DZE90066，購于北京博奧森公司）。FR-988生物顯微圖像分析儀（上海復(fù)日科技有限公司制造），電子分析天平TB-2002 DENVER（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)），切片機(jī) LEICA RM 2016（上海企偉實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型的建立[1] 將牛Ⅱ型膠原蛋白溶解于0.1 mol·L-1醋酸中，制成2 mg·mL-1溶液，將溶液與弗氏完全佐劑按1∶1比例制成乳劑。在各組大鼠尾根部、右足足墊皮下各注射1個(gè)部位，每只每次0.1 mL；3周后采用同樣方法再次進(jìn)行免疫注射，每只每次0.2 mL [1，3，5-6]。4周后模型造成。根據(jù)關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Arthritic Index，AI）[2]的評定。關(guān)節(jié)積分評定每周2次，全身病變按5級評分法評價(jià)，4個(gè)肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算AI。積分越高，表示關(guān)節(jié)癥狀越重。每只大鼠最高16分，造模的大鼠AI≥4分認(rèn)為造模成功。4周后再通過蘇木精-伊紅（Hematoxylineosin staining，HE）染色觀察大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜病理改變，根據(jù)AI及病理改變情況確定CIA模型大鼠造模成功。本實(shí)驗(yàn)造模60只大鼠全部成功，成功率達(dá)到100%。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 60只大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型組，痹痛康丸低、中、高劑量組，MTX組，每組10只，雌雄各5只。

2.3 給藥方法 空白對照組與模型組：無藥物干預(yù)，第5周開始灌服生理鹽水，每只2 mL，每日1次，連續(xù)給藥4周。痹痛康丸低、中、高劑量組和MTX組均在第5周開始給藥，每日1次。痹痛康丸低劑量組灌服0.3 g·kg-1·d-1，中劑量組為

3 g·kg-1·d-1（約為臨床人體用量的10倍），高劑量組為30 g·kg-1·d-1，MTX組每周1.2 mg·kg-1（約為人體用量每周10 mg）。以上各組藥物溶解于2 mL生理鹽水中，各組連續(xù)給藥4周。其中MTX組每周灌服MTX溶液1次，其余6 d自由飲食。人與大鼠劑量轉(zhuǎn)換按如下公式：D=D'×R/ R'×（W'/W）1/3。

D，D'分別是兩種動(dòng)物的每公斤體質(zhì)量給藥劑量；R，R'分別是兩種動(dòng)物的體質(zhì)量系數(shù)，大鼠和人的值分別為90和100；W，W'分別是兩種動(dòng)物的體質(zhì)量。

2.4 IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)量檢測方法 給藥4周后，采取大鼠心臟血每只約2 mL，處死大鼠，將血液靜置30 min后離心 10 min，分離血清；大鼠處死后，取右踝關(guān)節(jié)組織固定、包埋。組織切片制作采用HE染色，IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)檢測采用免疫組化SP法。在IL-1β、IL-6表達(dá)檢測過程中，每個(gè)染色流程均有對照作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，陽性對照采用陽性組織切片，陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。每張免疫組化切片置于低倍鏡（×100）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Smartscape圖像分析系統(tǒng)分析所有圖像，采用平均灰度值反映IL-1β、IL-6蛋白在組織中的表達(dá)強(qiáng)弱。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05

為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變 從大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片中可見，模型組滑膜組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞變圓，滑膜增厚，并有明顯骨破壞和小血管增生。各用藥組除痹痛康丸低劑量組外均較模型組病理改變有不同程度的減輕，痹痛康丸低劑量組滑膜組織與模型組比較未見明顯變化。痹痛康丸中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，滑膜厚度趨于正常，小血管增生較模型組和痹痛康丸低劑量組明顯減少，未見明顯骨破壞。

3.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)量的變化 陰性對照切片上踝關(guān)節(jié)滑膜組織未見IL-1β、IL-6蛋白陽性表達(dá)，其他各組切片可見IL-1β、IL-6蛋白免疫反應(yīng)陽性的棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)。與空白對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），痹痛康丸中、高劑量組、MTX組IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)與模型組相比顯著升高

（P<0.05），痹痛康丸低劑量組大鼠滑膜IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P>0.05），痹痛康丸中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)IL-1β蛋白表達(dá)與MTX組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P>0.05）。痹痛康丸中劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)IL-6蛋白表達(dá)與MTX組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），

痹痛康丸高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)IL-6蛋白表達(dá)低于痹痛康丸中劑量組、MTX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），

見表1。

4 討 論

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“歷節(jié)”等范疇。因患者先天不足、正氣虛弱，風(fēng)、寒、濕、熱等外邪侵襲，致機(jī)體氣血、肝腎虧虛，痰濁瘀血阻絡(luò)，臨床以關(guān)節(jié)、肌肉、筋骨疼痛、腫脹、麻木，關(guān)節(jié)屈伸不利、甚至關(guān)節(jié)僵硬畸形為主要表現(xiàn)。痹痛康丸方中鹿角霜、熟地黃等益腎填精以固其本，制附子、桂枝等溫經(jīng)散寒、通經(jīng)止痛，羌獨(dú)活、蜈蚣、烏梢蛇、地龍等祛風(fēng)勝濕、搜風(fēng)活血，薏苡仁、防己利濕消腫，黃芪益氣，赤芍活血，白芍、生地黃養(yǎng)陰緩急并防桂附等辛熱之藥燥血。上述諸藥配合攻不傷正，補(bǔ)不礙邪，處方平穩(wěn)，適合RA患者長期服用。前期實(shí)驗(yàn)[1，6]表明，痹痛康丸能明顯改善CIA大鼠癥狀，減輕大鼠胸腺和脾臟重量，減輕或抑制關(guān)節(jié)滑膜炎癥，具有減輕或消除關(guān)節(jié)腫脹的作用；可使大鼠血清CD4+、CD8+比值降低，并可抑制大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)，提示痹痛康丸能有效抑制滑膜中新生血管的形成。CIA為非感染性炎癥，病理變化為增生性滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨破壞等，MTX 可使體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞中IL-1誘導(dǎo)產(chǎn)生COX-2減少，但對COX-1、

COX-2的mRNA表達(dá)無直接影響；抑制RA患者滑膜組織中中性粒細(xì)胞的趨化性，使炎癥關(guān)節(jié)處的COX進(jìn)一步降低，而且MTX可抑制前炎癥因子TNF的表達(dá)[7]，因此，MTX對CIA有治療作用。

在RA滑膜增生與關(guān)節(jié)破壞的過程中，IL-1β是其中起著重要作用的細(xì)胞因子，關(guān)節(jié)組織中主要由滑膜細(xì)胞軟骨細(xì)胞分泌、由巨噬/單核細(xì)胞產(chǎn)生，在RA炎癥反應(yīng)和組織損傷中發(fā)揮重要作用。在RA致病過程中，IL-1β可促使細(xì)胞表面分子在成骨細(xì)胞或骨襯里細(xì)胞中的表達(dá)，正是表面分子的表達(dá)促使了以上變化的發(fā)生。IL-1常由局部免疫復(fù)合物與游離膠原等分解產(chǎn)物刺激產(chǎn)生，進(jìn)而促使滑膜和軟骨細(xì)胞生成基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致滑膜炎和軟骨基質(zhì)成分的降解破壞，此過程反復(fù)繼而形成惡性循環(huán)[8-9]。此外，IL-1β可通過與成骨細(xì)胞部分受體結(jié)合，增加核因子-κβ受體激活因子配體的表達(dá)，刺激大量炎性因子IL-6和IL-8分泌產(chǎn)生，這兩個(gè)因子與RA血管翳的生成以及關(guān)節(jié)軟骨侵蝕密切相關(guān)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡紊亂導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)破壞和滑膜炎癥，IL-1β和TNF-α在RA發(fā)病機(jī)制過程中起關(guān)鍵作用，IL-1β可刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs）產(chǎn)生，同時(shí)抑制膠原和糖蛋白合成，這說明了IL-1β有加重骨損傷的作用，且有研究顯示TNF-α有類似作用，但作用不及IL-1β強(qiáng)烈[8]。IL-6是一種多效的細(xì)胞因子，曾被稱為B細(xì)胞分化生長因子，能刺激B細(xì)胞成熟，促進(jìn)RF和其他自身抗體的產(chǎn)生。在炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)具有關(guān)鍵性且多樣的作用。IL-6可強(qiáng)力誘導(dǎo)產(chǎn)生急性期反應(yīng)蛋白（如C-反應(yīng)蛋白）誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為能分泌IgG型抗體的漿細(xì)胞，介導(dǎo)前列腺素類因子的生成，促進(jìn)IL-1、腫瘤壞死因子（TNF）和類風(fēng)濕因子的分泌[10]。IL-6不僅是重要的致炎細(xì)胞因子，且參與骨關(guān)節(jié)重建過程中的細(xì)胞間相互作用。在RA發(fā)病過程中，IL-6可以通過提高成骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中細(xì)胞核因子κB活化因子配體的釋放，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成因子的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證明，IL-6既能激活B細(xì)胞促進(jìn)自身抗體產(chǎn)生，又能通過誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生和IL-2R的表達(dá)而活化T細(xì)胞，并可與IL-2結(jié)合，促使T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其分泌的炎性CK如IL-1β、TNF-α、IL-6和RA的滑膜炎高度相關(guān)[10-11] 。

在RA發(fā)病進(jìn)程中，IL-6與TGF-β共存在并發(fā)揮協(xié)同作用，誘導(dǎo)大量Th17細(xì)胞形成。由Th17分泌的強(qiáng)致炎性細(xì)胞因子IL-17與TNF-α協(xié)同誘導(dǎo)IL-6高表達(dá)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞和FLS分泌MMPs，激活破骨細(xì)胞降解結(jié)締組織，加劇骨侵蝕[11-12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，IL-1β、IL-6在模型組大鼠踝關(guān)節(jié)中的表達(dá)明顯高于痹痛康丸中、高劑量組，且痹痛康丸中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)IL-1β表達(dá)與MTX組比較無差異，說明痹痛康丸能有效降低關(guān)節(jié)組織對IL-1β的分泌。痹痛康丸高劑量組IL-6表達(dá)量低于MTX組，說明痹痛康丸還能有效降低關(guān)節(jié)組織對IL-6的分泌。

本研究發(fā)現(xiàn)，痹痛康丸具有降低CIA大鼠關(guān)節(jié)組織對IL-1β、IL-6的分泌，抑制CIA大鼠滑膜炎癥、血管翳生成，延緩骨破壞的作用。相信隨著痹痛康丸對RA治療作用的深入研究，能為RA的有效防治開辟新的途徑。

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