葉帥 王鳳德 張一卉等

同等第一作者：葉 帥（1981-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳學(xué)；王鳳德（1979-），男，副研究員，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。

摘要：Ran是一種大量分布于細(xì)胞核內(nèi)的小分子的GTP酶，在核質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中具有十分重要的作用，參與調(diào)控細(xì)胞分裂及其信號(hào)傳導(dǎo)。本研究利用基于同源序列的PCR技術(shù)，從小立碗蘚（Physcomitrella patens）中成功克隆了PpRan基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）序列，并對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了相關(guān)分析。利用半定量PCR技術(shù)對(duì)PpRan基因在不同組織中以及受到缺磷脅迫時(shí)的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，PpRan基因的表達(dá)具有組織特異性，莖葉體和原絲體中表達(dá)量較高，假根中表達(dá)量比較低；PpRan基因受缺磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量越來(lái)越高。這些結(jié)果表明，PpRan基因可能在小立碗蘚響應(yīng)缺磷脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：小立碗蘚；PpRan基因；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）06-0015-05

磷是植物生長(zhǎng)所必須的礦質(zhì)元素，缺磷常導(dǎo)致植物的分枝比正常植株少，莖、根纖細(xì)，植株矮小，花果容易脫落等。但土壤中的磷一般不能滿(mǎn)足農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，必須通過(guò)施肥來(lái)補(bǔ)充，這無(wú)疑增加了作物種植的成本，也存在破壞生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如能克隆與缺磷脅迫耐性相關(guān)的基因，并通過(guò)基因工程手段改良作物將對(duì)農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)環(huán)境都具有重要的作用。

GTP結(jié)合蛋白（GTP-binding protein）也叫G蛋白，廣泛存在于生物界，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著極為重要的作用。低分子量GTP結(jié)合蛋白的相對(duì)分子量通常在20～30 kD之間，根據(jù)分子量大小可以劃分為Ras、Rap、Seg、Arf等七種不同的亞類(lèi)[1]。其中Ran（Ras-related nuclear）也稱(chēng)為T(mén)C4[1]，在動(dòng)物中參與調(diào)控細(xì)胞周期中各個(gè)時(shí)期的生命活動(dòng)，如：調(diào)控核運(yùn)輸、啟動(dòng)細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄和加工（或修飾）、有絲分裂和減數(shù)分裂的開(kāi)始和結(jié)束的控制、紡錘體的組裝、染色體的正確分配、核膜破裂和重組等。但到目前為止，關(guān)于Ran蛋白參與調(diào)控植物逆境脅迫反應(yīng)的研究鮮有報(bào)道，尤其是對(duì)缺磷脅迫的耐性。

苔蘚植物是自然界的拓荒者之一，能生活于沙磧、荒漠、凍原地帶及裸露的石面或新斷裂的巖層上，這種生活的特性可能與其本身的分子調(diào)控機(jī)制相關(guān)。因此，本研究以小立碗蘚（Physcomitrella patens）為材料，對(duì)其Ran基因進(jìn)行了克隆和相關(guān)表達(dá)模式的研究，不僅為了解Ran蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，也為植物的抗逆育種提供了理論參考。

1 材料與方法

11 試驗(yàn)材料

小立碗蘚由德國(guó)Ralf Reski 教授惠贈(zèng)。

12 試驗(yàn)方法

121 PpRan基因cDNA編碼序列的克隆 利用Trizol 法提取小立碗蘚總RNA，采用上海申能博彩生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一條鏈。利用NCBI上公布的小麥、水稻及擬南芥Ran基因的EST序列，通過(guò)BLAST比對(duì)找出小立碗蘚中同源的EST并進(jìn)行拼接，找出PpRan的ORF，設(shè)計(jì)特異性引物分別為PpRan-F：5′-ATGGCATTGCCCGGGCAGCAGACTCC-3′和PpRan-R：5′-CTAGCTGTCAAAGGCGTCATCGTCGT-3′。以小立碗蘚反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連pGEM-T easy vector System后測(cè)序驗(yàn)證。

122 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 利用DNAMAN 軟件，對(duì)不同物種（小麥：Triticum aestivum，AAL303961；水稻：Oryza sativa Japanica Group，NP_0010435501；擬南芥：Arabidopsis thaliana，AAN318651；釀酒酵母：Saccharomyces cerevisiae S228C，NP_0148281；果蠅：Drosophila yakuba，XP_0021009021；小家鼠：Mus musculus，NP_033417；人Homo sapiens：NP_0063161）來(lái)源的Ran蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)分析，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。使用MEGA 40 對(duì)不同物種中的Ran蛋白做系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用Bootstrap Test -Neighbor Joining 方法，重復(fù)500 次運(yùn)算。

123 PpRan基因在不同組織中的表達(dá)模式分析 用Trizol法分別提取小立碗蘚莖葉體、假根、原絲體組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄。分別以莖葉體、假根、原絲體的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用PpRan-F/R引物PCR擴(kuò)增PpRan基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)不同組織PpRan基因的表達(dá)水平。以小立碗蘚Actin基因（AW698983）作為內(nèi)參，擴(kuò)增引物為：PpActin-F：5′-CGGAGAGGAAGTACAGTGTGTGGA-3′和PpActin-R：5′-CTGGGCTCAATTCTAACGGCTGGT-3′。

124 小立碗蘚受缺磷脅迫時(shí)PpRan基因的表達(dá)模式分析 將小立碗蘚植株在不加入磷元素的固體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中的KH2PO4用等量的KCl代替）中培養(yǎng)，進(jìn)行缺磷處理，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的小立碗蘚作為對(duì)照。在處理后第1、2、4、7、9天取小立碗蘚假根，用Trizol法提取小立碗蘚假根RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用PpRan-F/R引物PCR擴(kuò)增PpRan基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)不同處理時(shí)期PpRan基因的表達(dá)水平。并以小立碗蘚Actin基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增引物同123。2 結(jié)果與分析

21 PpRan基因編碼區(qū)克隆及分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約為700 bp的DNA片段（圖1），將其命名為PpRan。經(jīng)測(cè)序，PpRan ORF大小為672 bp，預(yù)測(cè)編碼223個(gè)氨基酸。將預(yù)測(cè)的氨基酸序列提交NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)Ras類(lèi)GTP結(jié)合蛋白共有的保守區(qū)域（圖2），這些區(qū)域是GTP及其輔助因子結(jié)合的區(qū)域。其中，“GDGGTGKT”與GXXXXGK（S/T）功能區(qū)相對(duì)應(yīng)，是磷酸結(jié)合位點(diǎn)；“YEPTIGVEV”為Effector Loop區(qū)域；“WDTAGQE”區(qū)域負(fù)責(zé)結(jié)合GFP的τ-磷酸；“NKVD”與NKXD功能結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)，對(duì)鳥(niǎo)嘌呤有特異的介導(dǎo)作用；“EISA”與FMETSA區(qū)域相對(duì)應(yīng)，可與NKXD區(qū)域的D殘基發(fā)生相互作用。

同源比對(duì)分析結(jié)果表明，PpRan編碼的氨基酸序列與擬南芥、水稻、小麥、釀酒酵母、人的相似性分別達(dá)到了89%、87%、86%、73%、71%（圖3）。在進(jìn)化上與植物Ran蛋白具有更高的親緣

關(guān)系（圖4）。在動(dòng)物中，Ran蛋白的C末端缺乏一個(gè)作為異戊二烯化受體位點(diǎn)的半胱氨酸殘基，擁有一個(gè)酸性的C末端序列DEDDDL，而植物中的C末端保守序列為DDDDDL，小立碗蘚是比較低等的植物，在進(jìn)化上僅僅高于藻類(lèi)，低于蕨類(lèi)植物，其C末端保守序列與高等植物存在差異，為DDDDDA。

22 PpRan基因的表達(dá)模式分析

半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，PpRan基因在莖葉體中的表達(dá)量最高，其次是在原絲體中，在假根中表達(dá)量很低（圖5A）。因此，PpRan基因的表達(dá)具有組織特異性。

由圖5B可以看出，受缺磷脅迫時(shí)PpRan基因表達(dá)量有所上升，并且隨著缺磷脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量越來(lái)越高，但處理后第7天和第9天沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明表達(dá)量維持在此水平。

A：PpRan基因在小立碗蘚不同組織中的表達(dá)模式，其中泳道1為假根，泳道2為莖葉體，泳道3為原絲體；B：PpRan基因?qū)θ绷椎捻憫?yīng)，其中泳道1為對(duì)照，泳道2～6分別為缺磷處理后1、2、4、7、9天PpRan的表達(dá)

3 討論

本研究克隆了小立碗蘚Ran基因并對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)定，利用分子生物學(xué)分析軟件和網(wǎng)絡(luò)資源對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并根據(jù)基因序列和結(jié)構(gòu)對(duì)其功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。PpRan蛋白與其它植物有很高的同源性，屬于植物Ran蛋白家族的一個(gè)成員。Ran是Ras蛋白的一個(gè)亞類(lèi)，具有Ras蛋白的共同特點(diǎn)，所有的Ras蛋白都有相似的結(jié)構(gòu)域[2]：N端1～165氨基酸是Ras蛋白功能結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)結(jié)合、水解GTP；不同種類(lèi)的Ras蛋白之間的差異主要發(fā)生在166～185氨基酸殘基區(qū)域；Ras蛋白的C端有4個(gè)氨基酸殘基組成的CAAX-BOX，其中C為半胱氨酸Cys，A代表任何一種脂族氨基酸，CAAX-BOX使Ras蛋白吸附在膜上，而與膜結(jié)合是Ras蛋白實(shí)現(xiàn)其生理功能所必須的。本實(shí)驗(yàn)從小立碗蘚中克隆得到的編碼低分子量GTP結(jié)合蛋白的PpRan基因，其編碼的氨基酸序列C端沒(méi)有4個(gè)氨基酸殘基組成的CAAX-BOX，而是一段呈酸性的序列“PLPDDDDDA”，這與大多數(shù)Ras蛋白的特點(diǎn)不同，可能是PpRan蛋白為核蛋白，與擬南芥[3]、煙草[4]、馬鈴薯[5]的Ran蛋白相同，都是可溶的，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，不需要錨定在膜上。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小立碗蘚不同組織中的PpRan基因的表達(dá)情況做了研究，發(fā)現(xiàn)在莖葉體中表達(dá)量最高，在原絲體組織中的表達(dá)量次之，假根中表達(dá)量最低，說(shuō)明PpRan在小立碗蘚中的表達(dá)具有組織特異性?？赡芮o葉體是小立碗蘚最成熟、光合作用等發(fā)生的部分，因此表達(dá)量較高；原絲體是二維狀態(tài)的小立碗蘚組織，只是小立碗蘚發(fā)育的一個(gè)過(guò)渡階段，因此表達(dá)量較莖葉體次之；假根不是傳統(tǒng)意義上的根，可能生活力較弱，表達(dá)量最低。在缺磷條件下，增強(qiáng)低濃度有效磷吸收能力是植物抵抗非生物脅迫所采取的一種適應(yīng)機(jī)制，而這一機(jī)制的實(shí)現(xiàn)需要高親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)子的高效表達(dá)。李玉京等[6]認(rèn)為在缺磷條件下植物對(duì)PO3-4吸收能力的增強(qiáng)信號(hào)，可能來(lái)自于植物體內(nèi)PO3-4濃度的變化。我們推測(cè)PpRan蛋白也可能參與了這一信號(hào)的傳導(dǎo)。Bun-ya等[7]在釀酒酵母Scerevisae中，分離到編碼小G蛋白的Gtr1基因，該基因不僅參與調(diào)控酵母細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)，而且和PH084 Pi轉(zhuǎn)運(yùn)子共同參與對(duì)Pi的吸收。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小立碗蘚進(jìn)行缺磷處理，半定量PCR發(fā)現(xiàn)，小立碗蘚假根中PpRan基因的表達(dá)量隨著磷缺乏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，這表明PpRan基因受缺磷脅迫的誘導(dǎo)，推測(cè)其可能在小立碗蘚對(duì)缺磷脅迫應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高建偉[8]對(duì)藍(lán)粒小麥Ta-Ran 1的磷饑餓脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果一致。由于小立碗蘚在進(jìn)化上低于小麥，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明了Ran-like基因在低等植物里也顯示出在高等植物中相似的功能。

小立碗蘚PpRan全長(zhǎng)cDNA編碼序列的獲得以及該基因在不同組織和在非生物脅迫條件下的表達(dá)特性研究結(jié)果，為進(jìn)一步研究其在非生物脅迫應(yīng)答基因網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)。PpRan基因編碼蛋白的生物學(xué)功能還需進(jìn)一步的研究。參 考 文 獻(xiàn)：

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