談暠媛

摘要：建立了魚肉組織中金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的多殘留檢測的高效液相色譜法（HPLC）。樣品經(jīng)0.1 mol/LEDTA-McIlvaine緩沖液（pH 4.0）提取離心后，上清液用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，選用安捷倫Eclipse plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5μm），以乙腈：甲醇：0.01 mol/L草酸溶液（2﹕1﹕7）為流動相，流速0.5 mL/min，350 nm波長處測定，外標(biāo)法定量。其3種藥物濃度在25～200 ng/mL時均與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果表明，3種目標(biāo)物質(zhì)在魚肉組織中的檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg。在不同濃度添加水平下測定，平均回收率在76.5%～89.1%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在10.00%以內(nèi)。

關(guān)鍵詞：金霉素；多西環(huán)素；米諾環(huán)素；多殘留；高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號：TS254.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）06-0017-05

四環(huán)素類（Tetracyclines，TCs）藥物是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、立克次氏體等均有很好的抑菌作用，常被用于畜、禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。目前國內(nèi)四環(huán)素類抗生素主要包括六種：金霉素、土霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、美他環(huán)素和米諾環(huán)素。

本文針對3種四環(huán)素類抗生素藥物的特性，研究其在魚肉中的多殘留檢測方法。方法采用高效液相色譜法，其具有選擇性高、分離效果好、檢測靈敏度高等優(yōu)點，其準(zhǔn)確度和回收率均能滿足國家規(guī)定的對四環(huán)素類藥物殘留限量的要求，具有較好的通用性和推廣性。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀 （配2487型紫外檢測器）；分析天平；回旋振蕩器；旋渦混合器；數(shù)顯恒溫水浴鍋；高速冷凍離心機(jī)；氮吹儀；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL）

1.2 藥品與試劑

金霉素（CTC）、多西環(huán)素（DC）、米諾環(huán)素（MINO）標(biāo)準(zhǔn)品含量均大于80.0%。草酸、無水磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四醋酸二鈉均為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純；水為重蒸餾水。

1.3 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別精密稱取金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用適量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于0 ℃冰箱中冷藏避光保存。保存期為1個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用流動相稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

0.01 mol/L草酸水溶液的配制：稱取草酸1.26 g，加水溶解，稀釋到1 000 mL。

0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）的配制：稱取無水磷酸氫二鈉28.4 g，加水溶解，稀釋到1 000 mL。稱取檸檬酸21.0 g，加水溶解，稀釋到1 000mL。將上述磷酸氫二鈉溶液625 mL和檸檬酸溶液1 000mL混合，加入乙二胺四醋酸二鈉60.5 g，使其溶解，搖勻。必要時，用0.1 mol/L鹽酸溶液或0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0±0.05。

洗脫液（0.01 mol/L草酸-甲醇溶液）的配制：稱取草酸1.26 g，加甲醇溶解，稀釋到1 000 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱∶ 安捷倫Eclipse plus C18：250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；流動相∶乙腈∶甲醇∶ 0.01mol/L草酸溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至2.5）=2∶1∶7；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長：350 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確量取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相分別稀釋成25、50 、100 、200 、500 、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，供儀器分析，每個濃度重復(fù)檢測兩次，取其平均峰面積值為縱坐標(biāo)，再分別以金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合，求標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.3 樣品的提取和凈化 稱?。?.00 ±0.05）g試樣，置于50 mL塑料離心管中，加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH 4.0）15 mL，渦旋混勻1 min，用回旋振蕩器振蕩20 min后，15 ℃，6 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈50 mL塑料離心管中，在殘渣中再加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液10 mL重復(fù)提取一次，渦旋混勻1 min，15 ℃，6 000 r/min離心10 min，合并兩次上清液，渦旋混勻，6 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈50 mL塑料離心管，備用。

Oasis HLB固相萃取小柱依次用5 mL甲醇，5 mL水活化。取上述備用提取液10 mL過柱，調(diào)節(jié)流速小于1 mL/min，待樣液完全流出后用5 mL水淋洗，擠干。用3 mL 0.01mol/L草酸-甲醇溶液洗脫，擠干，將收集的洗脫下來的溶液置于40 ～45 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑昧鲃酉? mL溶解殘余物，渦旋混勻1 min后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液供高效液相色譜檢測。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系

結(jié)果表明，在濃度為25～200 ng/mL的范圍內(nèi)，金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素的峰面積與其濃度呈良好的線性關(guān)系。

（1）CTC： y=1.09e+002x-6.36e+002 r=0.999 8；

（2）DC： y=1.66e+002x-9.69e+002 r=0.999 6；

（3）MINO： y=1.91e+002x-4.54e+002 r=0.999 9

2.2 方法的檢測限和定量限

本方法在金霉素、多西環(huán)素及米諾環(huán)素的加標(biāo)量為25 μg/kg時，經(jīng)提取后測定，3種四環(huán)素類藥物的信噪比S/N大于3；在加標(biāo)量為50 μg/kg時，其信噪比S/N大于10，回收率均大于80.0%。故最終確定該方法的檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg，低于國家規(guī)定的四環(huán)素類抗生素的最高殘留限量100 μg/kg。結(jié)果表明，該方法滿足殘留分析的要求，具有可行性。

2.3 方法的回收率、精密度及空白試驗

確定檢測方法后，分別以陰性的鳙魚為空白樣品，通過人為添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測其方法的回收率。試驗中分別在樣品[每份（5.00±0.05） g]中添加0.250、0.500、1.000 μg的金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素進(jìn)行回收試驗，添加濃度分別相當(dāng)于50 、100 、200 μg/kg，平行樣共5份，同時考察了其日內(nèi)精密度，其試驗結(jié)果見表1、表2、表3。其日間精密度是采用100 μg/kg的加標(biāo)濃量測定其回收率，每日測定一次，連續(xù)測定4 d，其結(jié)果見表4。

從表1、表2、表3可知，3種不同添加濃度的樣品回收率在76.5%～89.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10.0%以內(nèi)。批內(nèi)及批間變異系數(shù)均在10.00%以下。由表4可見，3種藥物在100 μg/kg的加標(biāo)濃度下，其回收率在79.9%～90.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)。

空白試驗：用陰性的魚肉組織作為空白樣品，按相同的方法進(jìn)行試驗，其測定結(jié)果表明，在與對照品中3種藥物相應(yīng)的保留時間里，空白樣品對待測的目標(biāo)藥物無干擾。

3 分析

3.1 液相色譜分析條件的確定

3.1.1 色譜柱的選擇 本試驗先后試過幾種不同品牌的色譜柱，結(jié)果表明，普通的C18色譜柱均可以將金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素較好地分離，只是在出峰時間、峰形以及峰面積上稍有不同，只要對流動相的成分比例做輕微的調(diào)整，均能使3種四環(huán)素類抗生素得到理想的分離。故本文最終選擇了安捷倫Eclipse plus C18色譜柱。

3.1.2 檢測波長的確定 四環(huán)素類藥物的分子結(jié)構(gòu)上帶有兩個發(fā)色團(tuán)，在近可見光區(qū)有強(qiáng)烈的紫外吸收性質(zhì)。經(jīng)過對3種四環(huán)素類藥物分別進(jìn)行波長掃描并反復(fù)試用后，發(fā)現(xiàn)雖然270 nm波長處紫外有最大吸收，但檢測基線干擾較大，峰型對稱性較差，拖尾較嚴(yán)重，最終確定檢測波長為350 nm。

3.1.3 流動相的選擇

（1）流動相成分的選擇。由于四環(huán)素類抗生素具有酸堿兩種性質(zhì)，且其在堿性環(huán)境中會處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，在中性環(huán)境下又會和多種金屬離子產(chǎn)生螯合物。而這種金屬螯合物對反相色譜柱有吸附的作用，影響峰形的對稱性，產(chǎn)生拖尾峰，所以一般常在其流動相中加入如EDTA、磷酸和草酸等有機(jī)酸[1]。

對其峰形和分離度進(jìn)行綜合考慮，以乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液為流動相時，樣品基質(zhì)的雜質(zhì)干擾峰較小，響應(yīng)值較高，無明顯拖尾現(xiàn)象。

（2）流動相pH對試驗的影響。流動相的pH對試驗有很大的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，0.01 mol/L的草酸溶液pH約為2.0時，對CTC、DC、MINO 3種藥物的分離度均為3.0以上，較為理想，但是米諾環(huán)素的出峰時間較早，約為4.0 min左右，容易與樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾峰混在一起，影響其定量檢測的準(zhǔn)確性。當(dāng)pH大于3.5時，金霉素和多西環(huán)素的保留時間很接近，分離度達(dá)不到要求，且同時3種藥物峰形也受到很大的影響，理論塔板數(shù)迅速下降，且出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，金霉素和多西環(huán)素的響應(yīng)很低，影響了其檢測的靈敏度。

經(jīng)反復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)草酸水溶液的pH為2.5時，3種目標(biāo)藥物峰能和雜質(zhì)峰很好地分離，保留時間適中，峰形較好，且無明顯拖尾現(xiàn)象。

（3） 流動相配比對試驗的影響。米諾環(huán)素因容量因子最小，出峰時間最早，容易與樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾峰重疊，對其定量檢測造成影響；但是有機(jī)相的比例太低又會引起出峰時間太晚，產(chǎn)生拖尾，降低檢測靈敏度，而多西環(huán)素的容量因子是待測的3種藥物中最大的，出峰時間最晚，拖尾最為嚴(yán)重[2]。試驗采用了3種不同的比例∶乙腈∶甲醇∶0.01mol/L草酸溶液分別為=4∶2∶4； 2∶1∶8； 2∶1∶7，經(jīng)過反復(fù)對比，發(fā)現(xiàn)最后一種比例對3種物質(zhì)的分離度、峰形、靈敏度和保留時間等最為合適。

3.2 樣品前處理方法的確定

3.2.1 提取溶劑的選擇 在生物組織中，四環(huán)素類藥物極易與蛋白質(zhì)結(jié)合，需使用酸性溶液使其脫蛋白，從中提取待測的四環(huán)素類抗生素。但是酸性太強(qiáng)（pH<2.0）會導(dǎo)致四環(huán)素類抗生素降解生成脫水產(chǎn)物，且加熱時會轉(zhuǎn)變成差向異構(gòu)體。所以提取液必須選用弱酸性溶液[2-5]。在本試驗中分別用0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）、Mcllvaine緩沖液、5%高氯酸、5%三氯乙酸4種不同的提取液對添加了1 μg/g藥物的魚肉組織進(jìn)行提?。ㄒ来问褂?5mL、10mL提?。?，測定3種藥物的平均回收率。結(jié)果表明，0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）的綜合提取效率最好。

3.2.2 樣品的凈化

（1）固相萃取小柱的選擇。Oasis HLB固相萃取小柱是一種親水親脂平衡的水可清潤性反向吸附型萃取柱，對極性化合物有良好的保留能力，其可耐受廣泛的pH范圍和溶劑，保留藥物的容量也比一般的傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)填充的萃取小柱要高3倍。

四環(huán)素類藥物的凈化一般采用Oasis HLB柱和C18固相萃取小柱。為了比較哪種萃取小柱對四環(huán)素類藥物的回收率最好，做了一個試驗性實驗。處理添加待測藥物的樣品（添加量100 ng/g），使其同時過Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）和Agilent C18（500 mg，3 mL）兩種萃取小柱，比較其回收率及凈化效果。結(jié)果表明，Waters Oasis HLB柱效果較好，回收率高，雜質(zhì)干擾少。

（2）淋洗液的選擇。在樣品溶液全部過柱后，除了金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素3種目標(biāo)待測物附著在HLB萃取柱的吸附床上外，還有一些化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性相似的雜質(zhì)和其他抗生素可能也附著在上面，所以需要用淋洗液進(jìn)行淋洗，用于去除小柱吸附床上的大部分雜質(zhì)，對樣品進(jìn)一步凈化，本文中分別用5 mL的水、2%甲醇/水、5%甲醇/水、8%甲醇/水進(jìn)行淋洗后，將淋洗液收集，檢測其金霉素、多西環(huán)素及米諾環(huán)素的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了用8%甲醇/水作為淋洗液的洗滌液中含少量的待測物質(zhì)外，其他的洗滌液中均檢測不出目標(biāo)物質(zhì)。由于前3種淋洗液的效果差不多，為了使操作簡便化，最終采用5 mL水作為淋洗液。

（3）洗脫液的選擇。反向萃取柱一般使用甲醇、乙酸乙酯、正己烷、異丙醇等有機(jī)溶劑作為洗脫液。根據(jù)四環(huán)素類藥物的性質(zhì)，按照理論，甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇和流動相均可以將其洗脫下來。有資料顯示為了克服四環(huán)素類抗生素不穩(wěn)定以及易與共萃物難分開等問題，可在淋洗液中加入草酸以提高其回收率和改善凈化結(jié)果。試驗中將添加濃度為100 ng/g的樣品處理后，過Oasis HLB萃取小柱，用甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇溶液和流動相分別作為洗脫液處理樣品，洗脫液體積為3 mL，前兩種洗脫后，在40～45 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑昧鲃酉? mL溶解殘余物，過濾后檢測；后一種洗脫后直接過濾檢測。結(jié)果表明，采用0.01 mol/L草酸甲醇溶液作為洗脫液回收率高，雜質(zhì)干擾較少，效果最優(yōu)。

4 小結(jié)與討論

本研究通過反復(fù)試驗建立了檢測魚肉中金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的多殘留量的高效液相色譜法，確定了高效液相色譜檢測條件：色譜柱為安捷倫Eclipse plus C18柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，或相當(dāng)者；流動相為乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液（用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至2.5）=2∶1∶7，等梯度洗脫；流速為0.5 mL/min；檢測波長為350 nm；進(jìn)樣量為50 μL；柱溫為25 ℃。

方法中對樣品的提取凈化過程進(jìn)行了優(yōu)化，采用0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH 4.0）提取樣品中的待測藥物，用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，其操作簡單，雜質(zhì)較少，提取效果好，回收效率高。

結(jié)果顯示3種目標(biāo)藥物的線性范圍為25～200 ng/m L。通過加標(biāo)樣品的測定結(jié)果，確定了該方法中金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg。其回收率在76.5%～89.1%，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10.00%。

該檢測方法較現(xiàn)有的檢測四環(huán)素類藥物的方法創(chuàng)新之處在于：使用等梯度洗脫檢測魚肉組織中米諾環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的多殘留檢測；將流動相中的0.0 1mol/L的草酸溶液的pH調(diào)至2.5；使用0.01 mol/L草酸甲醇作為洗脫液，氮?dú)獯蹈珊笫褂昧鲃酉鄰?fù)溶。結(jié)果表明，此方法能達(dá)到較好的回收效果，證實了其適用性。

試驗中檢測的是魚肉組織，今后在相關(guān)試驗中還可以嘗試選用其他可食性動物組織進(jìn)行檢測，擴(kuò)寬其適用范圍。本文中檢測的只有3種四環(huán)素類抗生素，在今后的研究中可嘗試通過調(diào)整高效液相色譜條件和改進(jìn)樣品處理方法來檢測更多種類的四環(huán)素類藥物。

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