李龍虎等

【摘要】 目的 探討PDE5 shRNA對(duì)小鼠急性心梗后早期細(xì)胞凋亡的影響。方法 通過(guò)結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立小鼠心肌梗死模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=10）：將攜帶有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重組腺病毒載體注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)和對(duì)照組（n=10）：將沒(méi)有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒載體注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)。一周后，進(jìn)行免疫組化和TUNEL分析檢測(cè)梗死及梗死周邊細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 心梗1周后，和對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)域細(xì)胞凋亡明顯減少（P<0.05），梗死周邊心肌細(xì)胞凋亡明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 PDE5 shRNA的干預(yù)可以明顯減少心肌梗死及梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡和非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 短發(fā)夾RNA；干預(yù)治療；心肌梗死；磷酸二酯酶5抑制劑

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.061 文章編號(hào)：1004-7484（2013）-06-2921-02

近年來(lái)，隨著心肌梗死存活率的大幅提高，心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病率和死亡率都呈明顯上升趨勢(shì)[1]，已逐漸成為全世界范圍主要的發(fā)病和死亡原因之一，如何降低心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病率和死亡率，是心血管病防治領(lǐng)域中的關(guān)鍵問(wèn)題。盡管有一系列的治療措施，心衰患者的預(yù)后仍不盡人意[2]。心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡是觸發(fā)心室重構(gòu)導(dǎo)致心力衰竭的重要原因，阻止梗死后心肌細(xì)胞凋亡可以減少心室重構(gòu)，改善心功能[3]。早期干預(yù)有助于延緩心梗后心衰的進(jìn)展，對(duì)心梗的遠(yuǎn)期預(yù)后有不可估量的益處。

最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表達(dá)增加，并且會(huì)導(dǎo)致心梗后心室重構(gòu)[4]，可能是由于cGMP/PKG信號(hào)的下降，加劇心功能惡化。PDE5抑制劑對(duì)心臟有很多益處，通過(guò)持續(xù)抑制磷酸二酯酶可以減輕心肌梗死引起的心室重構(gòu)和心功能惡化，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)研究長(zhǎng)效磷酸二酯酶5抑制劑短發(fā)夾RNA（PDE5 shRNA）重組腺病毒載體對(duì)小鼠急性心肌梗死模型心肌細(xì)胞凋亡的影響并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性10周齡C57BL/6J小鼠（由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002），體重25-35g。

1.2.2 藥品與主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、10%FBS（Sigma公司）；Desmin一抗（SantaCruz）；TUNEL試劑盒（Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 PDE5shRNA重組腺病毒載體的建立 根據(jù)小鼠的PDE5A序列設(shè)計(jì)PDE5短發(fā)卡RNA，兩個(gè)互補(bǔ)PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根據(jù)鼠PDE5序列設(shè)計(jì)并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進(jìn)入載體pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，獲得鼠PDE5的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后將供體注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV 獲得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，沒(méi)有插入shRNA的普通腺病毒載體作為對(duì)照組，然后將攜帶有PDE5 shRNA和沒(méi)有PDE5 shRNA普通的腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，放在DMEM和10% FBS混合培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過(guò)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增病毒，并經(jīng)離心、提取、純化制備高滴度重組腺病毒載體。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備及分組 實(shí)驗(yàn)用雄性C57BL/6J小鼠若干只，按照文獻(xiàn)[5]的方法結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制小鼠心梗模型，并將建立好的模型隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=10）：將攜帶有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重組腺病毒（1x1010粒子/小鼠）注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)和對(duì)照組（n=10）：將沒(méi)有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒載體以同樣的方法注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)。隨后逐層關(guān)胸。手術(shù)嚴(yán)格無(wú)菌操作。

1.2.3 組織標(biāo)本處理 心臟標(biāo)本的留取一周后，所有存活小鼠麻醉狀態(tài)下，迅速取出心臟，冰生理鹽水沖洗干凈，垂直心臟長(zhǎng)軸將其評(píng)分為2段，部分心肌置入4%多聚甲醛溶液中固定，部分放置-80℃冰箱低溫保存。

1.2.4 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè) 對(duì)梗死及梗死周邊細(xì)胞采用TUNEL法檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)操作，光鏡下（20×20倍）觀察，陽(yáng)性細(xì)胞核為紅色，隨機(jī)選擇5個(gè)無(wú)重疊視野，分別記數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，二者百分比作為凋亡指數(shù)；隨后對(duì)梗死周邊心肌細(xì)胞采用雙免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)，首先以Desmin抗體為一抗進(jìn)行染色，用TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，DAPI用于著色細(xì)胞核，光鏡下（20×20倍）觀察，心肌細(xì)胞為綠色，陽(yáng)性細(xì)胞核為紅色，隨機(jī)選擇5個(gè)無(wú)重疊視野，分別記數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，二者百分比作為凋亡指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠細(xì)胞凋亡的情況 TUNEL（原位末端標(biāo)記法）分析顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)目減少（圖1），這表明，PDE5 hRNA明顯降低細(xì)胞凋亡發(fā)生率。

2.2 各組小鼠梗死周邊心肌細(xì)胞凋亡的情況 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠梗死周邊心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少（圖2），這表明，PDE5 shRNA明顯降低心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率。

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌梗死、心室重塑的重要病理改變，是導(dǎo)致心肌細(xì)胞減少的主要原因，從而造成心肌功能和結(jié)構(gòu)的損害[6]。本實(shí)驗(yàn)利用靶向磷酸二酯酶5的短發(fā)夾RNA（PDE5 shRNA）對(duì)急性心梗干預(yù)治療，可以明顯降低PDE5基因表達(dá)、降低細(xì)胞凋亡發(fā)生率。

隨著哺乳動(dòng)物進(jìn)化的演變，RNA干擾是一種固有的生物學(xué)現(xiàn)象[7]。生物學(xué)上，RNA干擾對(duì)短期和長(zhǎng)期阻斷蛋白表達(dá)有很重要的生理意義[8]。早先有報(bào)道稱shRNA質(zhì)粒可以在體內(nèi)保持1-4周的活性時(shí)間[9]，將shRNA作為一些特殊基因表達(dá)的靶基因，可能成為人類用作長(zhǎng)期預(yù)防一個(gè)非常有效的策略。于當(dāng)今治療心臟疾病的策略相比，這一新策略不用反復(fù)吃藥就能提供長(zhǎng)期有效地預(yù)防保護(hù)作用。在這項(xiàng)研究中，我們選擇PDE5作為目標(biāo)。PDE5在組織和肺血管系統(tǒng)中對(duì)平滑肌的作用很早就被公認(rèn)[10]。一篇最近的文獻(xiàn)報(bào)道，PDE5在心肌病病人左室表達(dá)增加，并且在心梗后導(dǎo)致心室重構(gòu)[11]。

細(xì)胞凋亡是由遺傳基因決定的程序性細(xì)胞死亡，可以被一些刺激激活，例如生長(zhǎng)因子的減退，凋亡受體信號(hào)或者細(xì)胞應(yīng)激。我們的免疫熒光檢測(cè)分析表明，PDE5 shRNA治療可以明顯降低梗死周邊區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡，這些觀察結(jié)果與早先的報(bào)道一致-即PDE5抑制劑西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡[12]，有人提出，cGMP/PKG 通路在PDE5抑制劑抗心肌細(xì)胞凋亡方面起到非常重要的作用[13]。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)PDE5 shRNA治療，PDE5 shRNA對(duì)心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞在梗死及梗死周邊區(qū)域的抗凋亡作用可以減輕心梗后心室重構(gòu)及心臟功能障礙。

總之，急性心肌梗死后PDE5 shRNA干預(yù)可以通過(guò)抑制PDE5表達(dá)明顯減輕細(xì)胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)或許可以為治療急性心肌梗死后的慢性心功能不全提供新的治療思路。

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