張倩馨　蔡永清

【摘要】 目的 通過對非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）患者外周血生存素（Survivin）mRNA的檢測；探討其對NSCLC診斷的臨床價(jià)值和意義。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測55例非小細(xì)胞肺癌患者、60例對照組的外周血Survivin mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 Survivin mRNA在NSCLC組的陽性率顯著高于對照組（P<0.01）。陽性表達(dá)率與臨床TNM分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與性別、年齡、病理組織類型無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 外周血Survivin可作為早期輔助診斷NSCLC及微轉(zhuǎn)移的一個(gè)有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 Survivin mRNA；外周血；RT-PCR；非小細(xì)胞肺癌

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.053 文章編號：1004-7484（2013）-06-2913-01

肺癌目前是全世界發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占80-85%[1]，但目前缺乏特異且敏感的早期病變的診斷指標(biāo)。外周血中腫瘤標(biāo)志物的檢測有助于發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法不能發(fā)現(xiàn)的存活于血循環(huán)中的微小腫瘤細(xì)胞灶。本研究旨在通過RT-PCR方法檢測NSCLC患者外周血中survivin mRNA的表達(dá)情況，探求NSCLC早期診斷、早期血道微轉(zhuǎn)移檢測的特異、敏感指標(biāo)，為臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 選擇2010年4月至2011年2月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的相關(guān)患者。惡性腫瘤組55例：男性31例，女性24例，年齡30-77歲；其中腺癌40例，鱗癌14例，大細(xì)胞癌1例。所有病例均經(jīng)病理檢查證實(shí)?；颊卟裳熬葱谢熁蚍暖?。對照組包括肺部良性病變組30例：男性18例，女性12例，年齡23-74歲；其中肺炎19例，肺結(jié)核球4例，炎性假瘤7例。正常健康對照組30例：男性15例，女性15例，年齡21-69歲，均無心、肝、肺等器質(zhì)性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在Gene Bank查找Survivin mRNA、β-actin mRN（內(nèi)參）基因序列，引物由大連寶生物公司合成。

1.2.2 標(biāo)本采集及Total RNA的提取 用枸櫞酸鈉抗凝經(jīng)去酶處理的采血管，取患者晨空腹肘靜脈血2.0ml。

淋巴細(xì)胞分層液分離核細(xì)胞，RNAiso Plus細(xì)胞裂解液裂解，氯仿，異丙醇進(jìn)一步抽提總RNA?？俁NA用紫外分光光度計(jì)定量，并行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，加入適量RNase-free滅菌水分裝-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件42℃30min、95℃5min、5℃5min。在PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃5min，變性94℃30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min.，Survivin mRNA復(fù)性62℃30s，β-actin mRNA56℃30s

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSSV17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，用X2檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料之間的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA鑒定 實(shí)驗(yàn)中所抽提取的總RNA，其檢測的OD260/OD280值為1.8-2.2之間。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳及EB染色分析可見28s、18s、5s三條帶，表明完整性良好。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增圖 用大連寶生物公司的DNA MarkerD（100bp-2000bp）作為相對分子量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)果可顯示5條帶（100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp）。指標(biāo)Survivin mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為439bp；以β-actin mRNA268bp作為內(nèi)參照，其在本實(shí)驗(yàn)所有標(biāo)本中均穩(wěn)定表達(dá)。陽性表達(dá)電泳圖表現(xiàn)為439bp出現(xiàn)亮帶。1%瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。

2.3 3組外周血Survivin mRNA 的表達(dá)情況比較 在55例非小細(xì)胞肺癌組中Survivin mRNA表達(dá)率為61.82%；肺良性病變組表達(dá)率6.7%；健康對照組無陽性表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌組較肺良性病變組及健康對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。Survivin mRNA在不同TNM分期、不同差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。不同病理類型組、不同年齡組、不同性別組的非小細(xì)胞肺癌患者，Survivin mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.446 、P=0.701和P=0.446），見表1。

3 討 論

多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者在確診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高非小細(xì)胞肺癌患者生存率和治愈率的關(guān)鍵。相對于傳統(tǒng)方法，外周血腫瘤標(biāo)志物檢測是一個(gè)合理、安全、花費(fèi)較小的選擇。非小細(xì)胞肺癌患者血循環(huán)中微轉(zhuǎn)移陽性的，生存期明顯縮短，預(yù)后差[2]。因此選擇適宜的方法，并在外周血中找到有助于非小細(xì)胞肺癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷的腫瘤標(biāo)志物具有重要的臨床意義。RT-PCR是具有高度敏感性及異性的檢測外周血腫瘤細(xì)胞的方法，目前得到了廣泛應(yīng)用，其檢測的是基因在mRNA水平表達(dá)的情況，能在106-107個(gè)正常的細(xì)胞中檢出1個(gè)腫瘤細(xì)胞，優(yōu)于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，適于用來檢測外周血循環(huán)中存在的微量腫瘤細(xì)胞。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的最具特異性的凋亡抑制因子之一。其特異性高表達(dá)于腫瘤組織，正常分化的組織則不表達(dá)。該特性決定了其可能為理想的腫瘤標(biāo)記物，并成為腫瘤鑒別診斷以及判斷預(yù)后等研究的新熱點(diǎn)。Yie等研究發(fā)現(xiàn)，Survivin表達(dá)陽性者具有較高的復(fù)發(fā)率，生存期較短；通過多因素分析，Survivin是癌癥復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子。Chen P的研究發(fā)現(xiàn)Survivin和臨床分期是對無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)測因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外周血survivin mRNA的檢測有助于早期血道微轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)，且隨著TNM分期的增高，Survivin mRNA陽性表達(dá)率也顯著增加，其在外周血中的表達(dá)可能是肺癌惡化發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移所伴隨的分子生物學(xué)變化，進(jìn)一步提示其與患者預(yù)后息息相關(guān)。本研究認(rèn)為采集外周血的方法，簡便、安全易于臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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[2] Yamashita JI，Kurusu Y，F(xiàn)ujino N，et al.Detection of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer undergoing lobectomy by video-assisted thoracic surgery：a potential hazard for intraoperative hematogenous tumor cell dissemination[J].Thorac Cardiovasc Surg，2000，119（5）：899-905.