王震靜等

【摘要】 目的 對雄性Wistar糖尿病大鼠外源性輸注脂肪乳，提高大鼠血液中游離脂肪酸（FFA）的濃度，觀察大鼠在不同濃度游離脂肪酸作用下，心肌細(xì)胞直徑的改變、腎小球體積的改變以及心肌和腎小球上白介素-6（IL-6）的不同表達(dá)。方法 制作糖尿病大鼠模型，按照隨機(jī)數(shù)字表編號將DM大鼠分入對照組和實(shí)驗(yàn)組，頸靜脈穿刺插管，在輸液前后，分別經(jīng)頸靜脈內(nèi)采血，分離血清，待檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，分離心臟及兩側(cè)腎臟，測量左側(cè)腎臟質(zhì)量，將心腎組織用4%中性甲醛固定，制作切片，進(jìn)行HE染色和免疫組化組織染色。EllisAE法檢測血清FFA，光學(xué)顯微鏡下測量各組大鼠心肌細(xì)胞直徑和腎小球面積，計(jì)算腎小球平均體積（VG）并計(jì)算腎重體重比值，測量各組的心肌和腎小球的IL-6光密度值，統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)之間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及其相關(guān)系數(shù)。結(jié)果 ①實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清FFA水平明顯升高，比對照組升高2-4倍。實(shí)驗(yàn)組大鼠隨著脂肪乳輸注時(shí)間的增加，腎重體重比值漸變大，4天組、6天組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與游離脂肪酸相關(guān)系數(shù)為0.782，P<0.01。實(shí)驗(yàn)組大鼠的腎小球體積隨著脂肪乳輸注時(shí)間的增加而增加，自2天組開始腎小球體積增大有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與血清中游離脂肪酸相關(guān)系數(shù)為0.837，P<0.01，與腎小球IL-6的表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.843，P<0.01。②對照組大鼠腎小球中IL-6基本不表達(dá)或弱表達(dá)，測量其平均光密度分別為0.1612、0.1583、0.1579；實(shí)驗(yàn)組大鼠IL-6水平較對照組明顯增高，2天組、4天組、6天組光密度分別為0.2173、0.4409、0.5294，2天組開始就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③心肌細(xì)胞HE染色顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠較對照組大鼠心肌細(xì)胞肥大，隨著脂肪乳輸注時(shí)間的延長，心肌細(xì)胞直徑漸增大，4天組、6天組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著脂肪乳輸注時(shí)間延長，心肌細(xì)胞局部IL-6表達(dá)增多，自2天組就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與FFA濃度相關(guān)系數(shù)為0.753，P<0.01，與心肌細(xì)胞局部IL-6光密度水平相關(guān)系數(shù)為0.808，P<0.01。結(jié)論 游離脂肪酸引起糖尿病大鼠腎重體重比值增加、腎小球體積增大、腎小球局部IL-6表達(dá)增加，并且隨著脂肪乳注射時(shí)間延長，上述改變明顯。腎重體重比值和腎小球的改變可能與局部IL-6高表達(dá)相關(guān)。游離脂肪酸引起糖尿病大鼠心肌細(xì)胞肥大，隨著FFA濃度的增加，肥大明顯，肥大改變可能與局部IL-6表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 Wistar大鼠；糖尿??；游離脂肪酸

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.004 文章編號：1004-7484（2013）-06-2863-02

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及糖尿病動(dòng)物模型的建立 健康雄性Wistar大鼠30只，6-8周齡，體重180-200g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。（SPF級），普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)l周，后給予高脂飲食4周。

使用前臨時(shí)配制STZ溶液。高脂飼料喂養(yǎng)4周后的大鼠，禁食12h過夜后，稱重，按照40mg/Kg，腹腔注射1%STZ一次。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)72小時(shí)，血糖檢測，空腹血糖（FBG）≥1l.lmmol/L者為DM大鼠，有28只經(jīng)檢驗(yàn)成模，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 研究對象和分組 按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分入輸入生理鹽水的對照組和輸入脂肪乳的實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)給予高脂飲食一周，對照組普通飼料飼養(yǎng)。

1.3 方法操作

1.3.1 大鼠頸靜脈穿刺插管手術(shù) 稱重，用3%戊巴比妥鈉（4mg/Kg）腹腔注射麻醉，暴露并分離右側(cè)頸靜脈，以PE50軟質(zhì)塑料管行頸靜脈插管，插管深度約1-2cm。遠(yuǎn)端穿過皮下固定于頸背部皮膚處。

1.3.2 靜脈輸注 經(jīng)大鼠頸背部導(dǎo)管采血后，靜脈導(dǎo)管與微量輸液裝置連接，以微量輸液泵24小時(shí)連續(xù)輸注。FFA組（n=15）：輸注20%英脫匹利特+肝素鈉（英脫匹利特：肝素鈉=lml：40UI），輸注速率0.6-1ml/h，以維持循環(huán)中FFA水平高于基礎(chǔ)值2-4倍，輸液持續(xù)2-6天（FFA-2d：n=5，F(xiàn)FA-4d：n=5，F(xiàn)FA-6d：n=5）；NS組（n=13，NS-2d，n=5，NS-4d，n=4，NS-6d，n=4）以相同速率（0.6-1.0ml/h）連續(xù)靜脈輸注生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，經(jīng)頸靜脈內(nèi)采血，分離血清，于-80℃冰箱保存，測定血FFA水平。

1.4 主要試劑與儀器

1.4.1 主要儀器 ①顯微照相系統(tǒng)，日本奧林巴斯（Olympus，TurboScan）

②生物顯微照相分析系統(tǒng)，（日本Olympus，BX51）。

1.4.2 試劑 ①血清游離脂肪酸試劑盒，上海研吉生物科技有限公司；②免疫組化試劑盒一抗、二抗、DAB顯色劑均購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.5 切片制作 分離心臟、腎臟，左側(cè)腎臟除去包膜稱重，取心臟組織，腎臟組織固定于4%的中性甲醛中，制切片，并進(jìn)行HE常規(guī)組織染色和IL-6免疫組化染色。

1.6 IL-6組織局部沉積 IL-6染色陽性物質(zhì)為棕黃色，利用顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，分析腎小球內(nèi)IL-6在組織局部表達(dá)的情況，可見對照組大鼠腎小球中IL-6基本不表達(dá)或弱表達(dá)，平均光密度分別為0.1612、0.1583、0.1579；實(shí)驗(yàn)組大鼠，腎小球中IL-6水平較對照組增高，2天組﹑4天組﹑6天組的光密度分別為0.2173、0.4409、0.5294，2天組開始就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 腎重體重比值和平均腎小球體積的計(jì)算 計(jì)算各對照組和實(shí)驗(yàn)各組中大鼠的腎重體重比值，得出，實(shí)驗(yàn)4天組腎臟體重比值開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)用OlympusBX51分析系統(tǒng)測定各組大鼠HE染色腎小球等效直徑和平均截面積（AG），據(jù)公式VG=l.38/1.1×AG3/2算出腎小球平均體積（VG），并計(jì)算其與游離脂肪酸的相關(guān)性，經(jīng)PEARSON分析其相關(guān)系數(shù)為0.837。

1.8 心肌細(xì)胞直徑（MCD）測定 將心肌切片在400倍光學(xué)顯微鏡下測定MCD，每張HE染色切片選取6-8個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野測量5-10個(gè)心肌細(xì)胞，每一標(biāo)本測量50個(gè)心肌細(xì)胞，以平均值作為該樣本MCD進(jìn)行分析。在被測定的心肌細(xì)胞，在橫向上，細(xì)胞核位于細(xì)胞的中央，其最短徑線為MCD[1]。2天組開始大鼠心肌細(xì)胞較對照組大鼠相比直增徑大。心肌細(xì)胞直徑與游離脂肪酸濃度的相關(guān)系數(shù)經(jīng)PEARSON分析為0.789，與心肌局部IL-6水平的相關(guān)系數(shù)r為0.808。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量結(jié)果用（χ±s）表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性用PEARSON相關(guān)分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 論

2.1 隨著脂肪乳輸注時(shí)間的延長，糖尿病大鼠體內(nèi)FFA濃度增高，腎重體重比值增加、腎小球體積增大，腎小球局部IL-6的表達(dá)指標(biāo)—光密度也有增高趨勢，腎臟的體積增大可能與局部IL-6高表達(dá)相關(guān)。

2.2 隨著脂肪乳輸注時(shí)間的延長，糖尿病大鼠體內(nèi)FFA濃度增高，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞直徑變大，隨著FFA作用時(shí)間的延長，肥大病變趨于明顯，且局部IL-6表達(dá)增加，說明FFA可能引起心肌細(xì)胞肥大，并且程度與FFA濃度和持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，機(jī)制可能與局部IL-6表達(dá)水平相關(guān)，見表1、表2。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，從病理生理學(xué)和流行病學(xué)的角度都能說明糖尿病與大血管疾病的密切關(guān)系。糖尿病大血管病變在組織病理學(xué)上與動(dòng)脈粥樣硬化并無差異，但其發(fā)生早、進(jìn)展快、預(yù)后差，糖尿病大血管疾病的發(fā)生率和病死率更高。

FFA導(dǎo)致大血管病變的機(jī)制可能為：①FFA通過對NO生成的抑制，對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，血管內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈硬化的始動(dòng)因素。NO生成的減少，內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能受損，將啟動(dòng)和加速動(dòng)脈粥樣硬化病理過程發(fā)生。②FFA通過增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物損傷血管內(nèi)皮。③FFA增加導(dǎo)致脂蛋白成分異常：在膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白存作用下，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的膽固醇和VLDL的TG交換增加，形成富含膽固醇的致動(dòng)脈粥樣硬化的VLDL和富含TG而膽固醇少的HDL、LDL。肝脂肪酶或脂蛋白酶水解富含TG的LDL，形成有著更強(qiáng)致AS作用的小而密VLDL。富含TG的HDL更易被肝脂肪酶水解而失去心血管保護(hù)作用[2]。

文中通過研究論述糖尿病大鼠腎重體重比值與腎小球體積的增大可能機(jī)制，以期待對于糖尿病腎病的發(fā)病原因做一探究，對糖尿病腎病的早期預(yù)防和治療提供依據(jù)。

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