賀艷艷　潘輝　王娟娟等

摘要：利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增卡拉庫爾羊腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因，連接到pET-28b載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），在不同的IPTG濃度、時(shí)間、溫度條件下誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)。結(jié)果表明，原核表達(dá)載體pET-28b-TNF-α構(gòu)建成功，可在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件為誘導(dǎo)溫度37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間4 h、IPTG濃度1.0 mmol/L。

關(guān)鍵詞：腫瘤壞死因子α（TNF-α）；原核表達(dá)；表達(dá)條件

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1686-03

腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在體內(nèi)具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗寄生蟲、代謝調(diào)控、造血及炎癥前反應(yīng)等多種作用[1-3]。近年來對(duì)TNF-α及其阻斷劑在臨床應(yīng)用方面的研究獲得了可喜的成果[4-7]。本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增卡拉庫爾羊TNF-α基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28b-TNF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）菌株，對(duì)TNF-α的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為研究卡拉庫爾羊TNF-α在機(jī)體內(nèi)的作用、生物學(xué)活性及其在動(dòng)物疾病治療、飼料開發(fā)等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株、表達(dá)載體pET-28b（+）均由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、X-Gal、IPTG、dNTPs、DNA Marker、PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（AP）、Tris、TEMED等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET-28b-TNF-α的構(gòu)建與鑒定 提取卡拉庫爾羊淋巴細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴(kuò)增TNF-α基因，上下游引物分別為PF， 5′-GGCGAATTCCTCCCGTCTGGACTTGGATC-3′（劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)）；RF， 5′-GGCCTCG

AGGGACACCTTGACCTCCTGAAT-3′（劃線部分為Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-28b原核表達(dá)載體?；厥蘸笥肨4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行酶切及測序鑒定。

1.2.2 卡拉庫爾羊TNF-α融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-28b-TNF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，后取1 μL轉(zhuǎn)接到100 μL新鮮的含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基。分別在不同的誘導(dǎo)溫度（37、39、42 ℃）、時(shí)間（1、2、3、4 h）和IPTG濃度（0.5、1.0、1.5 mmol/L）條件下進(jìn)行TNF-α融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后收集1 mL表達(dá)菌，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入2×SDS緩沖液20 μL和2 μL 二硫蘇糖醇（DTT），渦旋混勻，12 000 r/min離心1 min，100 ℃加熱5 min以使蛋白質(zhì)變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測表達(dá)的融合蛋白[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增卡拉庫爾羊TNF-α基因

以卡拉庫爾羊淋巴細(xì)胞RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增得到卡拉庫爾羊TNF-α基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰明亮，長度約為1 300 bp，與預(yù)期目標(biāo)片段大小相符，測序結(jié)果表明得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 268 bp，與已知的TNF-α基因序列一致。

2.2 卡拉庫爾羊重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-TNF-α的鑒定

將構(gòu)建的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-TNF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，對(duì)陽性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，質(zhì)粒雙酶切后得到明顯的兩條條帶，大小分別為1 300 bp和5 000 bp左右。

2.3 TNF-α融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有表達(dá)載體pET-28b-TNF-α的大腸桿菌BL21（DE3）菌株在不同溫度和時(shí)間條件下培養(yǎng)，添加不同濃度的IPTG進(jìn)行TNF-α融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果見圖3。采用BandScan 5.0軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明誘導(dǎo)溫度37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)4 h時(shí)的蛋白表達(dá)量較高，占菌體蛋白表達(dá)量的21.6%（圖4）。

3 小結(jié)與討論

大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)便捷的、能在體外高效表達(dá)真核基因的系統(tǒng)，該系統(tǒng)不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，因而對(duì)外源基因表達(dá)后大多數(shù)產(chǎn)物通常以包涵體形式存在，導(dǎo)致蛋白沒有活性。但大腸桿菌BL21（DE3）系統(tǒng)能讓研究者獲得較滿意的蛋白表達(dá)量，從而為以后的實(shí)驗(yàn)提供大量的蛋白原料。

在原核表達(dá)系統(tǒng)中除了需要表達(dá)菌株，還需要表達(dá)載體，pET系列載體在原核表達(dá)載體中較為常用，可利用誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)外源蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)選用了技術(shù)非常成熟的融合型原核表達(dá)載體pET-28b，pET-28b全長5 369 bp，帶有卡那青霉素抗性篩選基因，該載體包括T7啟動(dòng)子、LacZ操縱子序列、LacI調(diào)控基因、多克隆位點(diǎn)等。該載體還含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，當(dāng)用Ni-NTA樹脂純化蛋白時(shí)，6個(gè)組氨酸標(biāo)簽與其有很強(qiáng)的親和性，這樣有利于蛋白的純化。此外，融合表達(dá)能提高目的蛋白的表達(dá)量，降低外源蛋白對(duì)表達(dá)宿主菌細(xì)胞的毒性。

影響蛋白表達(dá)的因素很多[9-15]，本研究只選擇了3個(gè)，即誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度。溫度和時(shí)間是影響融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的重要因素，選擇合適的誘導(dǎo)溫度和時(shí)間可以促進(jìn)菌體的生長，提高產(chǎn)物的表達(dá)量。但培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致菌體代謝產(chǎn)生的毒素積累，從而影響菌體生長，降低蛋白的表達(dá)水平。IPTG對(duì)蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用，其濃度過高也會(huì)抑制大腸桿菌的生長。本試驗(yàn)結(jié)果表明，卡拉庫爾羊TNF-α融合蛋白在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG的條件下誘導(dǎo)4 h，表達(dá)量達(dá)最高。

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