呂大倫 丁偉 張煒 王合麗 徐祥 李子虎

【摘要】目的探討重組人促紅細胞生成素（LHEPO）對大鼠皮膚切創(chuàng)形成的急性創(chuàng)面愈合的影響。方法 健康SD雄性40只大鼠建立急性創(chuàng)面動物模型，隨機分成低劑量組（50U/ LHEPO），中劑量組（100U/LHEPO），高劑量組（150U/LHEPO）和生理鹽水（NS）對照組， 造模同時進行外敷不同劑量LHEPO及生理鹽水治療。觀察每組大鼠創(chuàng)面愈合情況，并于傷后 3d， 7d ，14d取創(chuàng)面皮膚標本，免疫組織化學方法染色檢測創(chuàng)面VEGF的變化。結果與對照組比，治療7d后，中和高劑量LHEPO組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著增加（P < 0.05）；疫組化結果為血管內皮生長因子（VEGF）在高劑量和中劑量藥物治療組皮膚組織中高表達，在同一時間點與對照組有顯著性差異（P<0.05）。結論LHEPO能促進大鼠皮膚切創(chuàng)愈合創(chuàng)面微血管形成，加速創(chuàng)面愈合。

【關鍵詞】促紅細胞生成素；血管內皮細胞生長因子；創(chuàng)面愈合

【中圖分類號】 R64 【文獻標識碼】A【文章編號】1004-4949（2013）07-194-02

創(chuàng)傷修復是一個涉及多種細胞及其產物協(xié)同對細胞外基質進行重建和再生的過程，在這一過程中， 新生組織的生成必須依托于新生血管的生成， 才有可能促進創(chuàng)面快速愈合。目前已知作用于造血系統(tǒng)的促紅細胞生成素（ EPO）也能在體內誘導新生血管的形成，具有較強的促血管生成的活性。本實驗旨在通過大鼠建立急性創(chuàng)面動物模型，探討重組人促紅細胞生成素（LHEPO）對對大鼠皮膚切創(chuàng)形成的急性創(chuàng)面愈合的影響，為創(chuàng)面修復尋找新的用藥及治療途徑提供理論依據。

1材料與方法

1.1 主要藥品：

重組人促紅素注射液（北京四環(huán)生物制藥有限公司，批號：20120543）；生理鹽水（杭州民生藥業(yè)有限公司，生產批號：41203274）。

1.2 動物急性創(chuàng)面模型制作及分組：

雄性SD 大鼠40 只，體重200-220g，購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK（遼）2010-0001。SD大鼠于術前一天臀背部剃毛。10%水合氯醛以3.5ml/kg 的劑量腹腔注射麻醉， 在無菌條件下進行皮膚切創(chuàng)造創(chuàng)手術：常規(guī)手術消毒，在大鼠背部近臀部以脊柱為中心，做一個直徑大約為2.5cm 的創(chuàng)面，切除皮膚達肌肉筋膜層，形成急性創(chuàng)面，將造模后40 只SD 大鼠隨機分成四組，即模型組，重組人促紅素注射液低劑量組、中劑量組和高劑量組，生理鹽水對照組，每組10 只。造模同時進行外敷不同劑量重組人促紅素注射液及生理鹽水治療。各組大鼠每天創(chuàng)面用無菌生理鹽水進行清理后，創(chuàng)面分別均勻濕敷 50U/mL、100 U/mL、150U/mL 重組人促紅素注射液及生理鹽水，每日1 次，每次1mL，于傷后14 d 停止給藥。觀察每組大鼠創(chuàng)面愈合情況，并分別在3d，7d，14d 取材檢測指標。

1.3 觀察創(chuàng)面愈合率：每日拍照，游標卡尺測量： 創(chuàng)面愈合面積率=（原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積× 100%

1.4血管內皮生長因子（VEGF）檢測：

采用免疫組化方法檢測VEGF表達。石蠟切片（4μm）常規(guī)脫蠟，逐級水化，先經3 H2O2室溫下滅活內源性過氧化物酶活性20min，0.01 mol/L枸緣酸緩沖液行抗原修復，然后依次加入正常小牛血清（1：10）、VEGF（1：100）、生物素標記的兔抗鼠抗體、生物素標記羊抗兔抗體（1：200）、SP復合物 （1：200）。各步驟之間均經37。C恒溫箱孵育3Omin，PBS沖洗（小牛血清除外），最后DAB染色，蘇木索復染，樹脂封片。用PBS代替一抗作為空白對照。胞漿有棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞。

在400倍鏡下，隨機選取10個左右陽性表達視野，進行染色結果判斷：①根據著色的強弱對染色強度進行評分，0 分為無著色；1 分為淡黃色、略高于背景；2 分為棕黃色、明顯高于背景；3 分為強染、著棕褐色；②根據陽性細胞百分數對染色強度進行評分，0～2 分為陰性（-）；3～4 分為弱陽性（+）；5～6 分為陽性（++）；7 分為強陽性（+++）。兩者相加為免疫組化評分，取其平均值作為陽性表達量。

1.5數據統(tǒng)計：實驗結果均以平均值±標準差（x±s）表示，各組間均數比較用t 檢驗處理，以P < 0.05 為差異具有顯著性。

2結果

2.1創(chuàng)面愈合面積率檢測：結果顯示，與對照組比，治療7d后，人促紅素注射液中和高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著增加（P < 0.05）。

2.2各組VEGF表達量：

免疫組化結果：血管內皮生長因子（VEGF）在高劑量和中劑量藥物治療組皮膚組織中高表達，在同一時間點與模型組有顯著性差異（P<0.05）。具體結果如表2 和附圖2 所示。

3討論

促紅細胞生成激素（EPO）分子由165個氨基酸組成，相對分子量為34kD，是體內紅細胞增殖、分化以及維持外周循環(huán)紅細胞數量正常的最主要的調節(jié)因子。現(xiàn)有的研究表明 EPO 和 EPOR 不僅僅存在于幼紅細胞表面，也表達在不同的非紅細胞生成組織，如神經細胞、上皮細胞、心肌、平滑肌細胞、腫瘤細胞等[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)[2]EPO外用重組人促紅細胞生成素對大鼠皮膚深Ⅱ°燙傷創(chuàng)面可明顯提高創(chuàng)面愈合面積率，縮短創(chuàng)面愈合時間，加速創(chuàng)面愈合。Saher Hamed等[3]通過建立糖尿病大鼠全層皮膚缺損模型，創(chuàng)面局部應用含不同劑量重組人促紅素的乳膏，治療后12天發(fā)現(xiàn)給予EPO的創(chuàng)面愈合率、微血管密度（MVD）、VEGF與HP含量均明顯高于對照組，創(chuàng)面細胞凋亡程度明顯抑制，并表現(xiàn)出EPO濃度依賴性，提示EPO可以促進糖尿病大鼠創(chuàng)面的修復。Heiko Sorg等[4]研究發(fā)現(xiàn)重復低劑量EPO腹腔注射，也可以加速創(chuàng)面的愈合。如調控VEGF、內皮素、誘導型NO合酶、促紅細胞生成素等的表達，從而促進新生血管的形成和血管重構，調節(jié)血管張力和改善血管通透性，增強糖酵解及血氧容量，使機體組織對缺血缺氧產生耐受與適應，從而啟動創(chuàng)面修復機制。此外，受HIF調節(jié)的VEGF是影響血管新生的關鍵生長因子之一，是一種作用最強且唯一特異性作用于血管內皮細胞的促進血管生成因子，它既可提高血管通透性，又可直接作用于血管內皮細胞，刺激其分裂增殖，誘導新生血管生成并影響微血管的量，從而促進創(chuàng)面的生長愈合。

附圖

本研究結果表明，HLEPO外用可以促進創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合時間，其能夠促進愈合的原因，可能與其在～定程度上上調VEGF的表達水平有關，改善局部缺血缺氧狀態(tài)，促使血管新生，并最終促進創(chuàng)面愈合。這一新的外用藥物應用可望為臨床創(chuàng)面修復開辟一條的新途徑。

參考文獻

[1]Ahmed T， Haboubi N. Assessment and management of nutrition in older people and its importance to health[J]. Clin Interv Aging. 2010，5：207-16.

[2]周乾毅，蔡文佳，廖金敏，等.重組人促紅細胞生成素對大鼠皮膚深Ⅱ°燙傷創(chuàng)面愈合的影響[J]， 解剖學研究，2008，30（6），435-437.

[3]Saher Hamed， Yehuda Ullmann， Muhannad Masoud， et al. Topical Erythropoietin Promotes Wound Repair in Diabetic Rats[J]， J Invest Dermatol，2010， 130.

[4]Heiko Sorg， Christian Krueger， Torsten Schulz， et al. Effects of erythropoietin in skin wound healing are dose related[J]， The FASEB Journal， Vol. 23 3049-3058.