趙琪林

【摘 要】目的：為進(jìn)一步提高本單位在使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸方面的檢驗(yàn)水平。方法：對(duì)本單位的熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸的質(zhì)控考核結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：在本次質(zhì)控考核實(shí)驗(yàn)中，檢出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根據(jù)分子生物考核操作標(biāo)準(zhǔn)，本單位使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸方面的檢驗(yàn)情況合格。結(jié)論：熒光實(shí)時(shí)定量PCR法在檢測(cè)流感病毒核酸方面具有廣泛的應(yīng)用空間，可以為一些突發(fā)性公共性事件的檢驗(yàn)提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，值得進(jìn)一步推廣。

【關(guān)鍵詞】熒光實(shí)時(shí)定量PCR法；流感病毒核酸；質(zhì)控

熒光實(shí)時(shí)定量PCR法的臨床應(yīng)用，最大程度改善了傳統(tǒng)PCR法特異性不強(qiáng)、污染的問(wèn)題，并通過(guò)電腦軟件的配合性應(yīng)用[1]，實(shí)現(xiàn)了在每一輪循環(huán)都可檢測(cè)出一次熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量的檢測(cè)結(jié)果。目前，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法在臨床疾病診斷、動(dòng)物疫病檢測(cè)、食品安全等領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)揮出重要作用。為進(jìn)一步提高本單位在使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸方面的檢驗(yàn)水平。本文特對(duì)本單位的熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸的質(zhì)控考核結(jié)果進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 流感病毒滅活抗原標(biāo)本三份、流感病毒RNA提取液、流感病毒核酸熒光PCR法檢測(cè)試劑盒（甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒）、流感病毒核酸熒光PCR法檢測(cè)1?l9混合液、1?l混合酶、5?l處理完畢樣本，25?l反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)定量熒光檢測(cè)儀（型號(hào)為7300）、冷凍離心機(jī)（型號(hào)為38R）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn) 參照分子生物考核操作標(biāo)準(zhǔn)[2]、熒光實(shí)時(shí)定量PCR法操作規(guī)程流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2 具體實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.2.1 提取流感病毒核酸RNA 將流感病毒裂解液500?l和流感病毒培養(yǎng)液100?l加入到1.5ml離心管中，混合充分后加入乙醇溶液（70%）600?l，取出RNA提取柱將600?l混合液加入，使用冷凍離心機(jī)進(jìn)行15秒離心處理，設(shè)定離心速率為（12000rpm），棄去收集管液體[3]，在進(jìn)行15秒離心處理，設(shè)定離心速率為（12000rpm），再棄去收集管液體，加入清洗液RW1700?l，進(jìn)行15秒離心處理，設(shè)定離心速率為（12000rpm），取一干凈收集管移取RNA提取柱，在柱中加入清洗液RPE500?l，進(jìn)行15秒離心處理，設(shè)定離心速率為（12000rpm），棄去收集管液體，再次加入清洗液RPE500?l，進(jìn)行3分鐘離心處理，設(shè)定離心速率為（13000rpm），取出提取柱，移到一支1.5ml干凈離心管中，在柱中加入無(wú)核糖核酸酶水50?l，在20攝氏度室溫下放置2分鐘后，進(jìn)行1分鐘離心處理，設(shè)定離心速率為（12000rpm），拋棄提取柱，即得流感病毒核酸RNA，在20攝氏度下保存待用。

1.2.2.2 擴(kuò)增 流感病毒甲1型核酸熒光PCR法檢測(cè)19?l混合液、1?l混合酶、5?l處理完畢樣本，25?l反應(yīng)體系，選擇VIC熒光檢測(cè)通道[4]。流感病毒甲3型核酸熒光PCR法檢測(cè)19?l混合液、1?l混合酶、5?l處理完畢樣本，25?l反應(yīng)體系和流感病毒乙型核酸熒光PCR法檢測(cè)19?l混合液、1?l混合酶、5?l處理完畢樣本，25?l反應(yīng)體系選擇FAM熒光檢測(cè)通道。擴(kuò)增時(shí)，注意蓋好PCR反應(yīng)蓋，設(shè)定PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件[5]為：10分鐘45攝氏度—15分鐘95攝氏度15秒、60攝氏度60秒循環(huán)，反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增50次，根據(jù)基線最后取3個(gè)到15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)值。

1.2.2.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)Ct閾值大于等于40時(shí)表示結(jié)果為陰性，當(dāng)Ct閾值小于40時(shí)表示結(jié)果為陽(yáng)性。

2結(jié)果 在本次質(zhì)控考核實(shí)驗(yàn)中，檢出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根據(jù)分子生物考核操作標(biāo)準(zhǔn)，本單位使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸方面的檢驗(yàn)情況合格。

3討論

熒光實(shí)時(shí)定量PCR法，是指在PCR的反應(yīng)體系中加入特有的熒光基團(tuán)，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)積累信號(hào)檢測(cè)對(duì)PCR反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，再使用相應(yīng)電腦軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，最終達(dá)到對(duì)制定目標(biāo)的定量分析。熒光實(shí)時(shí)定量PCR法的臨床應(yīng)用顯著提高了傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)的缺點(diǎn)，經(jīng)臨床使用發(fā)現(xiàn)具有快速、穩(wěn)定、安全、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性高的諸多優(yōu)點(diǎn)，由于其整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都是在一個(gè)相對(duì)封閉環(huán)境中進(jìn)行的，所以大大降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是在實(shí)踐操作中我們也發(fā)現(xiàn)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法也存在一定顯著的缺點(diǎn)，例如：對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的要求比較高，需要操作人員數(shù)量掌握相關(guān)原理、步驟、要點(diǎn)，并且影響實(shí)驗(yàn)的因素也比較多，需要環(huán)境溫度等因素相對(duì)穩(wěn)定，此外實(shí)驗(yàn)成本比較高，在基層普及中存在一定困難。分析本次質(zhì)控考核實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次試驗(yàn)檢出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根據(jù)分子生物考核操作標(biāo)準(zhǔn)，本單位使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)流感病毒核酸方面的檢驗(yàn)情況合格。其中流感病毒乙型核酸未被檢測(cè)出來(lái)，分析原因認(rèn)為和實(shí)驗(yàn)試劑濃度有一定關(guān)聯(lián)，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法在檢測(cè)流感病毒核酸方面具有廣泛的應(yīng)用空間，可以為一些突發(fā)性公共性事件的檢驗(yàn)提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，值得進(jìn)一步推廣。

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