劉輝 高志安

【摘 要】目的：從分子水平上檢測(cè)蛋白激酶B和CDC25B在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)，探討PKB/CDC25B信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的意義。方法：應(yīng)用western印跡方法對(duì)2010年1月至2012年12月在遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的20例卵巢上皮性癌組織，正常卵巢組織10例，卵巢良性腫瘤15例的PKB和CDC25B的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果：PKB 與CDC25B western印跡檢測(cè)卵巢上皮性癌組織中磷酸化PKB蛋白和CDC25B蛋白與正常卵巢、卵巢良性腫瘤組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0. 01）。結(jié)論：磷酸化PKB蛋白和CDC25B蛋白與卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，有望成為卵巢上皮性癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】蛋白激酶B；CDC25B；上皮性卵巢癌

卵巢癌（ovarian Carcinoma）在女性生殖器惡性腫瘤中的發(fā)病率占第三位，嚴(yán)重威脅女性的生命和健康。盡管手術(shù)及術(shù)后化療是治療卵巢癌的主要手段之一，但是隨著化療耐藥的不斷出現(xiàn)，5年生存率仍徘徊在30%-50%左右[1，2]。近年來(lái)，人們對(duì)化療耐藥的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為可能與PI3K/Akt信號(hào)通路異常活化有關(guān)[3-5]，但此通路活化后下游底物蛋白CDC25B的表達(dá)如何變化還不清楚。本研究應(yīng)用western印跡方法對(duì)卵巢上皮性癌組織的PKB和CDC25B的表達(dá)進(jìn)行了分析，探討PKB/CDC25B信號(hào)通路在卵巢癌組織中的作用。

1 材料和方法

設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

時(shí)間及地點(diǎn)：于2010年1月至2013年1月在遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

材料：卵巢癌組織：2010年1月至2012年12月在遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的20例卵巢上皮性癌組織，正常卵巢組織15例，卵巢良性腫瘤10例。實(shí)驗(yàn)已得到遼寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署了標(biāo)本研究的知情同意書(shū)。

實(shí)驗(yàn)方法：

Western Blot方法檢測(cè)PKB、CDC25B的蛋白表達(dá)：用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢癌、

正常卵巢組織及良性卵巢腫瘤中的總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，-20℃或-80℃保存?zhèn)溆?。電泳前，加?*SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10 %SDS- PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，之后用含5%BSA的TBS（pH7.4）將濾膜于室溫?fù)u動(dòng)溫2 h進(jìn)行封閉，封閉后的濾膜再分別與PKB（1：1000稀釋?zhuān)?、Phospho-Akt（Ser473） （1：500稀釋?zhuān)?、CDC25B抗體（1：1000稀釋?zhuān)?、Phospho-CDC25B-S353 抗體（1：500稀釋?zhuān)┖挺?Actin（稀釋比為1：1000） 4℃溫育過(guò)夜。經(jīng)TTBS洗滌后，HRP偶聯(lián)的IgG作為二抗（稀釋比為1：5000）室溫溫育2 h，洗膜后，使用ECL發(fā)光法顯色。內(nèi)參采用β-Actin。計(jì)算機(jī)軟件Image J進(jìn)行密度分析，計(jì)算灰度值。

主要觀(guān)察指標(biāo)： Western Blot方法檢測(cè)PKB、Cdc25B的總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，多樣本均數(shù)檢驗(yàn)采用方差分析的方法。P < 0. 05為差異有顯著性意義， P < 0. 01為差異有極顯著性意義。

2 結(jié)果

PKB、PKB -pS473、Cdc25B、Cdc25B –pS353的蛋白表達(dá)水平

蛋白條帶分析結(jié)果表明，各組織內(nèi)的PKB和Cdc25B蛋白總體水平表達(dá)一致，各組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。與正常卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織相比，卵巢上皮癌組織中的磷酸化PKB -pS473和Cdc25B –pS353的表達(dá)明顯增強(qiáng)，有顯著性差異（P<0.01）。

3 討論

蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB/Akt）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝，蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞凋亡、增殖和存活等生命活動(dòng)。PKB屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是P3IK下游的直接靶蛋白之一[6，7]。近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PKB在細(xì)胞周期G1/S期和G2/M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。

CDC25 （cell division cycle 25）是Thr/Tyr雙特異性蛋白磷酸酶，在細(xì)胞周期中充當(dāng)重要角色。哺乳動(dòng)物中三種相關(guān)的CDC25B基因產(chǎn)物在進(jìn)化上高度保守，分別稱(chēng)為CDC25A，CDC25B和CDC25C。CDC25B是CDC25 蛋白家族的最重要成員，貫穿細(xì)胞周期的各階段，由于在不同時(shí)期定位于細(xì)胞內(nèi)不同的位置，故在細(xì)胞周期各期轉(zhuǎn)換中起核心作用，是細(xì)胞有絲分裂的激活劑[8，9]。

在Hela細(xì)胞的研究中，PKB/Akt是CDC25B的上游激酶之一，可以將CDC25B的S353磷酸化并使其定位于胞漿[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞系中已分別發(fā)現(xiàn)存在高表達(dá)的PKB[3，5]和Cdc25B[11]。但是PKB/CDC25B信號(hào)通路對(duì)卵巢癌組織的影響在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PKB和CDC25B在正常卵巢、卵巢良性腫瘤及卵巢上皮性癌中的表達(dá)在蛋白總體水平無(wú)差異；磷酸化PKB蛋白和磷酸化CDC25B蛋白在卵巢上皮癌中均有過(guò)度表達(dá)， 與正常卵巢及卵巢良性腫瘤相比，其差異有顯著性意義，隨著對(duì)蛋白激酶PKB和CDC25B 磷酸酶研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到PKB和CDC25B可能是癌癥治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[12]。因此，研制PKB和CDC25B抑制劑對(duì)于開(kāi)發(fā)新的抗癌藥物具有極其重要的意義。

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