方斌 劉文剛 趙自明等

【摘要】目的：觀察關(guān)節(jié)內(nèi)注射參麥注射液治療家兔膝骨關(guān)節(jié)炎的療效。方法：以40只健康SPF級新西蘭家兔為研究對象，隨機分為正常對照組、模型組、參麥注射液組（以下稱參麥組）、利多卡因組和參麥注射液+利多卡因組（以下稱參麥+利多組）5組，每組8只，除正常對照組外，其余4組采用木瓜蛋白酶所致兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。正常對照組、模型組分別予關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.4 mL的注射用生理鹽水，參麥組注射0.4 mL參麥注射液，利多卡因組注射0.4 mL利多卡因，參麥+利多組注射二者混合液0.4 mL，每周1次，連續(xù)8次，觀察家兔步態(tài)、膝關(guān)節(jié)周徑及關(guān)節(jié)液中炎癥因子濃度。結(jié)果：造模后2周家兔步態(tài)除正常對照組外，其余4組造模前后步態(tài)均有明顯變化（P=0.018 < 0.05），參麥組與參麥+利多組給藥4次后步態(tài)與造模前無明顯差異（P = 0.021、0.012 < 0.05）；給藥8次后膝關(guān)節(jié)周徑變化與正常對照組比較，模型組膝關(guān)節(jié)周長增大，差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.0049 < 0.05），參麥組有所增大，差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.13 > 0.05），利多卡因組明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.029 < 0.05），參麥+利多組減小，但差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.77 > 0.05）；局部炎癥因子水平結(jié)果與正常對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.023，0.001，0.014 < 0.05），參麥組有所升高，差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.061，0.13，0.527 > 0.05），利多卡因組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.031，0.008，0.025 < 0.05），參麥+利多組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.087，0.17，0.18 > 0.05）。結(jié)論：關(guān)節(jié)內(nèi)注射參麥注射液能明顯改善模型兔步態(tài)，消除膝關(guān)節(jié)腫脹，同時可以降低關(guān)節(jié)液的炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；參麥注射液；關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療；實驗研究；家兔；實驗研究

退行性膝關(guān)節(jié)病（degenerative osteoarthritis， DOA）是臨床上的常見病、多發(fā)病之一，其特點為關(guān)節(jié)軟骨退化、變性和壞死，并在軟骨下骨及關(guān)節(jié)周圍有新骨形成[1-3]。DOA多發(fā)于中老年人，隨著年齡的增長，加之長期負重或過度使用，導致關(guān)節(jié)軟骨的退變。關(guān)節(jié)軟骨、骨骼的退變與機體其他組織（如心血管）退變有相似性，研究者從參麥注射液有營養(yǎng)心肌細胞的作用得到啟示[1，6]，利用膝關(guān)節(jié)腔注射給藥的方式，以達到直接營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨的目的。為探討參麥注射液防治膝關(guān)節(jié)退行性疾病的作用機制及局部用藥的安全性，探索防治DOA新思路，筆者于2011年12月開展本研究，現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級新西蘭家兔40只，由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號SCXK（粵）2011-0062。

1.2 實驗藥品及試劑 參麥注射液（四川三精升和制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z20053254，生產(chǎn)批號110914）每支10 mL；利多卡因注射液（江蘇濟川制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號110315）每支5 mL；

木瓜蛋白酶（活力200萬U，天津諾奧科技發(fā)展有限公司提供）；IL-1β、IL-6、TNF（廣州展晨生物科技有限公司，生產(chǎn)批號CK-E30015）。

2 方 法

2.1 造模與分組 40只家兔適應性喂養(yǎng)1周后，隨機取8只為正常對照組，給予關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5 mL

EDTANa2磷酸鹽緩沖液，其余家兔采用木瓜蛋白酶所致兔骨關(guān)節(jié)炎造模：將NaCl 0.4 g、NaOH 0.01 g、Na2HPO4 0.358 g及KH2PO4 0.024 g溶解在8 mL雙蒸水中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入EDTANa2 7.44 mg，震蕩溶解，再加入木瓜蛋白酶0.16 g溶解，測量液體pH值后，加入HCL調(diào)整pH值到6.5，以雙蒸水定容至10 mL，4 ℃低溫保存?zhèn)溆?。將上述備用?.60%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL

注入動物雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，第l，3，7天各注射1次。根據(jù)臨床上超疲勞容易提前出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病特點，每日強迫家兔活動30 min，2周后即得到穩(wěn)定的膝骨關(guān)節(jié)炎模型。造模成功后隨機分為模型組、參麥組、利多卡因組、參麥+利多組4組，每組8只。

2.2 給藥方法 造模2周后，參麥組關(guān)節(jié)腔注射參麥注射液0.4 mL（2 mg·kg-1）、利多卡因組關(guān)節(jié)腔注射利多卡因注射液0.4 mL（2 mg·kg-1）和參麥+利多組注射0.4 mL參麥注射液和利多卡因注射液混合液，正常對照組和模型組均關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.4 mL的注射用生理鹽水，每周1次，連續(xù)8次，于未次注射給藥后2 h，取血，不加抗凝劑，然后處死家兔。

2.3 觀察指標

2.3.1 家兔步態(tài)的評價 分別于造模前后、給藥期、末次給藥2 h，每日觀察，每4周進行1次步態(tài)評價，步態(tài)分級按Coderre的方法，即0級：正常行走；I級：輕微跛行，受試下肢略有彎曲；Ⅱ級：中度跛行，受試下肢剛觸及地面；Ⅲ級：重度跛行，受試下肢略離開地面，后足著地行走。

2.3.2 膝關(guān)節(jié)周長測量 分別于造模前后、給藥期、末次給藥2 h，麻醉，用軟尺測量各組動物膝關(guān)節(jié)部位周長，計算腫脹率后進行統(tǒng)計。

2.3.3 關(guān)節(jié)液炎癥因子濃度測定

2.3.3.1 標本取材 處死家兔仰臥位固定，于膝關(guān)節(jié)處剃毛，常規(guī)消毒、鋪巾，切開皮膚，暴露關(guān)節(jié)囊，用無菌注射器抽取2 mL無菌生理鹽水，進行關(guān)節(jié)腔灌注，屈伸活動膝關(guān)節(jié)5次，反復抽出注入5次。待關(guān)節(jié)液與生理鹽水混勻后，收集全部關(guān)節(jié)腔灌注液，測量關(guān)節(jié)液量，以所測關(guān)節(jié)液減去2 mL無菌生理鹽水作為關(guān)節(jié)液容量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3.2 關(guān)節(jié)液組織炎癥因子濃度測定 取所有動物關(guān)節(jié)液1 000 r·min-1離心5 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱，測白細胞計數(shù)，ELISA雙抗夾心法測IL-1β、IL-6、TNF濃度。

2.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析，方差齊，采用LSD方法進行兩兩比較，方差不齊，采用Tamhane方法進行兩兩比較；等級資料采用秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 家兔步態(tài)情況 經(jīng)秩和檢驗，除正常對照組外，其余4組造模前后步態(tài)變化，差異均有統(tǒng)計學意義，（P = 0.018 < 0.05）；與正常對照組比較，其余4組造模后步態(tài)變化，差異均有統(tǒng)計學意義（P = 0.022 < 0.05），見表1。

3.2 膝關(guān)節(jié)腫脹情況 見表2。

3.3 關(guān)節(jié)液炎癥因子濃度測定 見表3。

4 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)軟骨的退變?yōu)橹饕±硖卣?。近年來，隨著世界老齡化人口的日益增加，KOA的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都呈逐年上升趨勢，因而如何預防與治療KOA已經(jīng)成為各國骨科學界研究者面臨的重要課題。細胞因子在KOA病理改變過程中起重要作用，大量研究顯示，細胞因子是骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織炎性破壞降解的重要介質(zhì)，不僅協(xié)同抑制軟骨組織成分的合成，同時參與軟骨組織的破壞分解[4]。研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子在KOA發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用，能特異地作用于軟骨細胞及滑膜細胞，參與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的形成，抑制膠原蛋白和蛋白多糖的合成，介導關(guān)節(jié)軟骨的破壞[5-7]。本研究中采用兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶的方法復制KOA模型，注射2周時采用Lequesne的膝關(guān)節(jié)評估級別中的關(guān)節(jié)局部反應、關(guān)節(jié)畸形情況對模型進行嚴格評價，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；對KOA局部腫脹程度進行觀察，與正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹明顯，與KOA變化相同。

KOA屬中醫(yī)學“骨痹”范疇，多為正氣虛弱，復感外邪，閉阻經(jīng)絡而發(fā)病。一般認為KOA的病理機制是人體關(guān)節(jié)內(nèi)應力平衡失調(diào)，失調(diào)的原因是細胞因子造成了關(guān)節(jié)軟骨降解，加之關(guān)節(jié)周圍軟組織攣縮、粘連，且長期得不到糾正所致[8-9]。

關(guān)節(jié)內(nèi)注射參麥注射液能明顯改善兔的步態(tài)異常；模型組關(guān)節(jié)液IL-1β含量與正常對照組比較明顯升高，說明兔關(guān)節(jié)液中IL-1β是KOA病理改變的一種重要炎癥介質(zhì)。參麥注射液關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療后，兔關(guān)節(jié)液中IL-1β含量與型組比較有減少，與正常對照組比較仍然偏高，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），且關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)較模型組有所改善，說明參麥注射液關(guān)節(jié)內(nèi)注射療法對KOA進程中細胞因子IL-1β的生成具有一定的拮抗作用。我們在兔KOA模型制備成功后，進行參麥注射液關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療后8周發(fā)現(xiàn)模型組兔關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α含量與正常對照組比較明顯升高（P < 0.05），說明參麥注射液關(guān)節(jié)內(nèi)注射療法可以減輕局部的炎癥反應。

本研究結(jié)果顯示，參麥注射液關(guān)節(jié)內(nèi)注射能夠改善模型兔的步態(tài)、消除膝關(guān)節(jié)腫脹，同時可以降低局部組織的炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α水平，該治療方法的安全有效性，值得臨床進一步深入研究。

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