李瑤 王雷 付玉杰

摘要：利用從加拿大引進(jìn)的轉(zhuǎn)基因小球藻（Chlorella vulgaris）制備微藻油脂，探討影響小球藻生長的條件，如培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度等，以期獲得脂肪酸組成以C16和C18為主的藻株及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，將轉(zhuǎn)基因小球藻接種在氮磷質(zhì)量比為4∶3、pH 8.5的GM-SC培養(yǎng)基中，在28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，最終可得到生產(chǎn)狀況較好、生長速度較快的小球藻。

關(guān)鍵詞：小球藻（Chlorella vulgaris）；微藻油脂；脂肪酸；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：TK6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1905-03

隨著全世界石油資源日漸枯竭，人類面臨著能源缺乏的危機(jī)，同時，人類環(huán)境保護(hù)意識日漸增強(qiáng)，已逐漸認(rèn)識到以石油為燃料會造成嚴(yán)重的空氣污染，危害人類的身體健康[1]。而且石油燃燒產(chǎn)生的CO2會導(dǎo)致溫室效應(yīng)，破壞地球的生態(tài)平衡[2]。研究表明，生物柴油是最具有發(fā)展前途的柴油機(jī)替代燃料，是最重要的清潔燃料之一[3]。生物柴油是指以水生植物油脂、動物油脂等為主要原料，在催化劑的作用下通過可再生的動植物油與低碳醇酯交換制成的一種性質(zhì)與石化柴油非常相似的燃油[4]。生物柴油既可以單獨(dú)作為燃料使用，也可以與石化柴油調(diào)和使用。混合燃料不但能夠改善柴油機(jī)的排放特性[5]，還可以提高柴油的潤滑性。生物柴油作為可再生能源，可緩解人類社會對石油的依賴；對環(huán)境友好，大大降低柴油機(jī)對空氣的污染；燃點(diǎn)高于石化柴油，處理、運(yùn)輸、使用和貯藏都變得更加安全和便利。自從1981年南非首次提出生物柴油這一概念后，世界各國都十分關(guān)注這種“綠色能源”。現(xiàn)在許多國家都已經(jīng)開展了生物柴油的研制和生產(chǎn)[6]。

小球藻（Chlorella vulgaris）含有豐富的脂類，是制備生物柴油的重要原料。小球藻的光合作用效率高、生長周期短、生物產(chǎn)量高，而且環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)。小球藻是一種單細(xì)胞綠藻。改變小球藻培養(yǎng)基的化學(xué)成分可以使它的生長方式發(fā)生改變，由此提高小球藻的生長效率、獲得高含量脂肪，并且有利于小球藻細(xì)胞內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物（如脂類）的積累，降低生產(chǎn)成本[7]。本研究從加拿大引進(jìn)了轉(zhuǎn)基因小球藻，它的脂肪酸主要組成為C16和C18脂肪酸，且以C16∶0、C16∶1、C18∶1為主，即雙鍵數(shù)目通常為一個，從結(jié)構(gòu)上分析是理想的柴油替代品[8]。本研究探討影響小球藻生長的條件，優(yōu)化利用轉(zhuǎn)基因小球藻制備微藻油脂的培養(yǎng)條件，為利用小球藻制備生物柴油打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 供試小球藻藻種購自加拿大滑鐵盧大學(xué)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）GM培養(yǎng)基（1 L）：1.8 g尿素，1.25 g KH2PO4，1.00 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

2）SC培養(yǎng)基（1 L）：1.25 g KNO3，1.25 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

取GM培養(yǎng)基與SC培養(yǎng)基按比例混合制成GM-SC培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基氮磷質(zhì)量比的優(yōu)化 向培養(yǎng)基添加尿素、KH2PO4調(diào)至氮磷質(zhì)量比（尿素KH2PO4的質(zhì)量比）為1∶1、3∶2、4∶3和2∶1，并滅菌備用。在超凈工作臺中將轉(zhuǎn)基因小球藻藻種分別接種在4種氮磷質(zhì)量比的GM-SC培養(yǎng)基中，并做好標(biāo)記。將已接種小球藻的錐形瓶置于恒溫振蕩箱中，溫度調(diào)節(jié)到30 ℃，光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min振蕩培養(yǎng)。定期測定其在600 nm下的吸光度，重復(fù)3次，取平均值。用OD600 nm變化來表示小球藻的生長情況。

1.2.2 培養(yǎng)基pH的優(yōu)化 采用最佳氮磷質(zhì)量比的培養(yǎng)基配方，用0.5 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調(diào)至培養(yǎng)基pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在超凈工作臺中將轉(zhuǎn)基因小球藻藻種分別接種在6種pH的GM-SC培養(yǎng)基中，并做好標(biāo)記。將已接種的錐形瓶放置于恒溫振蕩箱中，溫度調(diào)節(jié)到30 ℃，光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min振蕩培養(yǎng)。定期測定其在600 nm下的吸光度，3次重復(fù)，取平均值。用OD600 nm變化來表示小球藻的生長情況。

1.2.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 將小球藻藻種接種到最適宜條件的培養(yǎng)基中，分別在26、28、30、32 ℃光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，定期測定其在600 nm下的吸光度，3次重復(fù)，取平均值。用OD600 nm變化來表示小球藻的生長情況。

1.2.4 脂肪酸的檢測 優(yōu)化條件后，在最佳條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻，并委托農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心檢測出轉(zhuǎn)基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸和硬脂酸）占總脂肪酸的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基氮磷質(zhì)量比對轉(zhuǎn)基因小球藻生長的影響

由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)基中氮磷質(zhì)量比為4∶3時，轉(zhuǎn)基因小球藻的生長狀況較好；而當(dāng)?shù)踪|(zhì)量比為2∶1時，轉(zhuǎn)基因小球藻的生長狀況較差。所以，在試驗(yàn)的范圍之內(nèi)，最適宜的氮磷質(zhì)量比為4∶3。

2.2 培養(yǎng)基pH對轉(zhuǎn)基因小球藻生長的影響

由圖2可知，這種轉(zhuǎn)基因小球藻比較適宜在堿性環(huán)境下生長，在pH 8.5～9.0的條件下，轉(zhuǎn)基因小球藻生長較好。在酸性條件下（pH 6.5～7.0），轉(zhuǎn)基因小球藻生長狀況較差。所以，在試驗(yàn)的范圍之內(nèi)，最適宜培養(yǎng)基的pH為8.5。

2.3 培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)基因小球藻生長的影響

由圖3可知，轉(zhuǎn)基因小球藻在28 ℃的培養(yǎng)條件下生長狀況最好，30 ℃的培養(yǎng)條件次之。由此可知，在試驗(yàn)的范圍之內(nèi)，最適宜的培養(yǎng)溫度為28 ℃。

2.4 脂肪酸檢測結(jié)果

委托農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸等）占總脂肪酸的比例，結(jié)果見表1?？梢奀18脂肪酸含量較高，C16脂肪酸含量一般，用該小球藻制備微藻油脂相對比較滿意。

3 小結(jié)

利用從加拿大引進(jìn)的轉(zhuǎn)基因小球藻進(jìn)行試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：將轉(zhuǎn)基因小球藻接種在氮磷質(zhì)量比為4∶3、pH 8.5的GM-SC培養(yǎng)基中，在28 ℃的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最終可得到生產(chǎn)狀況較好、生長速度較快的小球藻。試驗(yàn)優(yōu)化了利用轉(zhuǎn)基因小球藻制備微藻油脂的條件，為利用小球藻制備生物柴油打下了基礎(chǔ)。

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