張培莉等

【摘 要】目的：探討HLA-DRB1等位基因在中國青海藏族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的分布及意義。方法：采用PCR-SSP（聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法）技術(shù)，對(duì)87例RA患者和90例正常對(duì)照的HLA-DRB1*01，04基因型進(jìn)行檢測。結(jié)果：HLA-DRB1* 04，在RA組的頻率顯著高于正常對(duì)照組（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在兩組差別無顯著意義（P =0.621）。結(jié)論：HLA-DRB1位點(diǎn)在青海地區(qū)藏族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的分布具有豐富的多態(tài)性， HLA-DRB1* 04可能是青海地區(qū)藏族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的易感基因。

【關(guān)鍵詞】類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；HLA-DRB1基因；等位基因；藏族

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（ Rheum ato id Arthr itis， RA ）與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR基因在遺傳上的聯(lián)系在20世紀(jì)70年代被首先報(bào)道，研究人員發(fā)現(xiàn)HLA-DR4在70%的RA患者中出現(xiàn)，而在對(duì)照組中僅30%，具有 HLA-DR4基因的個(gè)體患RA的相對(duì)危險(xiǎn)性大約為4-5倍。[1]

基于國內(nèi)諸多學(xué)者對(duì)中國不同地區(qū)漢族RA人群HLA-DRB 1等位基因的研究，本研究在RA相關(guān)HLA-DRB1等位基因在全世界不同人種、不同種族中生物地理區(qū)分布不同的基礎(chǔ)上，測定青海地區(qū)藏族人群RA病人中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因的分布，探討青海地區(qū)藏族人群中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因與RA發(fā)病相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

RA 組為2011年10月至2012 年8月于青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院及青海省藏醫(yī)院就診的青海地區(qū)居住5年以上且無血緣關(guān)系的藏族人群RA 患者。其診斷依據(jù)為2010年ACR/EULAR聯(lián)合頒布新的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。男性21 人，女性66人，平均年齡（44.4±14.2）歲，對(duì)照組為青海地區(qū)居住且無血緣關(guān)系的藏族健康體檢人群 男性19人，女性71人，平均年齡（45.4±14.6）歲。兩組均為藏族，排除其它自身免疫性疾病和嚴(yán)重心、肝、腎疾病，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)兩組人員年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均符合Hardy–Weinberg平衡定律。

1.2 研究方法

1.2.1樣本采集：收集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血7 mL， 其中2 mL貯于EDTA抗凝的試管中，-20℃保存， 用于基因組DNA的提取。

1.2.2基因組DNA的抽提： 采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒（賽泰克生物科技有限公司），利用其獨(dú)特的細(xì)胞裂解和血紅素/蛋白沉淀技術(shù)， 結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法，從抗凝全血中得到并純化基因組DNA， DNA樣本保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HLA-DRB1* 04， 01等位基因的檢測：

采用PCR SSP法，按文獻(xiàn)合成引物序列：DRB101-F TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT，DRB101-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，產(chǎn)物長度 255bp；DRB104-F GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA，DRB104-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，產(chǎn)物長度 260bp；hGH-F GCCTTCCCAACCATTCCCTTA，hGH-R TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC，產(chǎn)物長度 429bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2.5×Buffer V 6.0?l，目的基因上下游引物（5?M）各1.0?l，內(nèi)參基因上下游引物（5?M）各0.4?l，KAPAHS Taq酶（5U/?l）0.1?l，模板DNA 1.0?l，ddH2O 6.5?l。反應(yīng)程序如下： 95℃ 10 min； 95℃ 30 s， 58℃ 60 s， 72℃ 60 s， 共35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10 min，終止。取PCR產(chǎn)物1μl，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用上海山富科學(xué)儀器有限公司的BioSens SC 810B凝膠成像系統(tǒng)拍照后觀察記數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以（x±s）表示樣本的均數(shù)， 兩樣本均數(shù)的比較采用t 檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本率的比較采用χ2，定義雙側(cè)P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

177例樣品DRB1* 04和01分型PCR擴(kuò)增如圖1， 2所示，內(nèi)參基因片段均被擴(kuò)增。得到分型結(jié)果如下：DRB1* 04在RA 組的頻率顯著高于對(duì)照組（P =0.028）； 它們的比值比（OR） （見表1）。HLA-DRB1*01低于對(duì)照組， 但兩組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.621）。（見表2）

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以慢性、進(jìn)行性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病。病因尚不明確，但遺傳和環(huán)境在發(fā)病機(jī)制中起著潛在的作用。

人類主要組織相容性抗原（MHC）擁有多態(tài)基因位點(diǎn)，繼承了表達(dá)于MHC基因位點(diǎn)上某一特定基因的人易患RA，這種特定基因被稱為與疾病相關(guān)的等位基因。對(duì)人類而言，位于細(xì)胞表面編碼MHC基因位點(diǎn)的細(xì)胞表面的蛋白被稱為人類白細(xì)胞抗原（HLA）。迄今為止，研究最深入的、與RA發(fā)病相關(guān)性最強(qiáng)的是HLAⅡ類分子。HLA基因不但可以將抗原遞呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)其活化，并且在胸腺中選擇釋放至外周血中的T細(xì)胞。參與RA發(fā)病的HLAⅡ類分子對(duì)啟動(dòng)T細(xì)胞反應(yīng)有著重要作用，同時(shí)它在關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)揮著更多的局部作用。[2]

HLAⅡ類分子HLA-DRB1等位基因是第一個(gè)與RA有關(guān)的易感性基因。與RA 易感性相關(guān)的HLA-DRB1共享表位（QK/RRAA）序列位于α-螺旋結(jié)構(gòu)的第70-74位氨基酸[3]。HLA-DRB1*0401，HLA-DRB1*0404，HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0405和HLA-DRB1*1402均攜帶這段序列。在文獻(xiàn)中，HLA-DRB1*04等位基因被報(bào)道在許多人群中與RA相關(guān)。其他與RA有關(guān)的等位基因HLA-DRB1*01在法國、拉丁美洲、亞洲和高加索有報(bào)道[4-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型RA患者中，如在多關(guān)節(jié)型RF陽性的RA患者中，DRB1*0401和*0404出現(xiàn)的頻率最高。

本研究采用SSP（序列特異性引物）多重PCR技術(shù)擴(kuò)增87例RA患者和90例正常對(duì)照HLA-DRB1等位基因， 低分結(jié)果共2亞型， 其中HLA-DRB1* 04，在RA組的頻率顯著高于正常對(duì)照組（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在兩組差別無顯著意義（P =0.621）。本次研究發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1* 04可能是青海地區(qū)藏族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的易感基因，與國內(nèi)學(xué)者蘇茵[10]、蔣真[11]研究結(jié)果相似。

綜上所述，HLA-DRB1* 04位點(diǎn)在青海地區(qū)藏族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的分布具有豐富的多態(tài)性， HLA-DRB1* 04可能是青海地區(qū)藏族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的易感基因。我國幅員遼闊，有必要在中國多個(gè)地區(qū)、多民族中進(jìn)一步探索HLA-DRB1多態(tài)性與RA發(fā)病相關(guān)性，并進(jìn)一步探討其作用。

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