張志剛

摘 要：利用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜建立豬肉中13種磺胺類藥物殘留的同時、快速分析方法。豬肉樣品中的殘留藥物用1%乙酸-乙腈均質(zhì)提取，濃縮后用0.1%甲酸-乙腈定容，并用正己烷液-液分配除脂后，用Kinetex C18色譜柱（100mm×2.1mm，2.6?m）分離，以0.1%甲酸-乙腈作為流動相梯度洗脫，采用電噴霧正離子電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。13種磺胺類藥物在1～300μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限均小于10μg/kg。在1、2μg/kg和10μg/kg這3個添加水平下，回收率在60.0%～78.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.24%～8.88%之間。此方法操作簡便，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均滿足殘留分析的要求。

關(guān)鍵詞：豬肉；磺胺；液相色譜；質(zhì)譜

Simultaneous Determination of Thirteen Sulfonamides in Meat using HPLC-MS/MS

ZHANG Zhi-gang

（State Key Laboratory of Food Safety Technology for Meat Products， Xiamen Yinxiang Group Co. Ltd.， Xiamen 361100， China）

Abstract：AHPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of thirteen sulfonamides in pork.The sulfonamide residues were extracted with acidic acetonitrile. The extract was concentrated and then defatted using hexane， filtered with 0.22 μm filter membrane and transferred into sample vial， ready for HPLC-MS/MS analysis. Chromatographic separation was performed on a Kinetex C18 （100×2.1 mm， 2.6 ?m） column using a gradient elution with water （0.1% formic acid） and acetonitrile as mobile phases. Mass spectrometer was operated in multiple reaction monitoring of positive ionization mode. Thirteen sulfonamides showed good linearity between 1 and 300 μg/kg， and their limits of quantitation were all below 10μg/kg. The average recoveries at three spiked levels of 1μg/kg、2μg/kg and 10μg/kg ranged from 60% to 78.1% with relative standard deviations of 0.24%～8.88%. The method is simple， sensitive and selective， and applicable for the routine simultaneous determination of sulfonamides in meat.

Key words：meat；sulfonamides；liquid chromatography；mass spectrometry

中圖分類號：O657 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是具有氨苯磺酰胺結(jié)構(gòu)藥物的總稱，由于其具有高效、低毒、價格低廉等特點，作為廣譜抑菌藥在畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。隨著我國居民生活水平的提高，豬肉的消費量增長很快，但是豬肉中SAs藥物殘留問題日益突出，引起了社會大眾的廣泛關(guān)注。SAs種類可達(dá)數(shù)千種，其中應(yīng)用較廣的就有幾十種。通過任何途徑攝入的SAs藥物都會在人體中蓄積，對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。SAs藥物具有一定的副反應(yīng)，比如導(dǎo)致過敏反應(yīng)、造血紊亂、泌尿系統(tǒng)損害等等，而且某些SAs藥物還具有潛在的致癌性。因此，世界各國都對此類藥物在禽肉中的殘留制定了嚴(yán)格的限量要求。美國規(guī)定磺胺氯噠嗪和磺胺甲氧噠嗪不得檢出，其他SAs藥物殘留最大限量為0.1mg/kg；日本規(guī)定磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲嘧啶殘留最大限量為0.02mg/kg，磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉殘留最大限量為0.03mg/kg。歐盟和我國規(guī)定禽肉中SAs藥物總量不得超過0.1mg/kg。

目前，禽肉中SAs的檢測方法主要包括微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法（TLC）[1]、氣相色譜/質(zhì)譜法（GC/MS）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3-5]、毛細(xì)管電泳法（CE）[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等。生物學(xué)方法雖然操作簡單，但是難以對不同類別的SAs進(jìn)行檢測。GC-MS具有較高的靈敏度和特異性，但衍生化過程復(fù)雜。HPLC和CE的靈敏度低，選擇性和特異性也不太理想，特別是在復(fù)雜基質(zhì)中低濃度SAs測定時表現(xiàn)的非常明顯。LC-MS/MS已經(jīng)成為復(fù)雜基質(zhì)中獸藥殘留的同時定性定量分析的主流方法，具有靈敏度高、選擇性好、分析效率高等優(yōu)點。LC-MS/MS已用于測定不同樣品基質(zhì)中的磺胺類藥物[7-14]。本實驗建立豬肉中13種常見SAs藥物殘留（磺胺甲噻二唑、磺胺異惡唑、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲惡唑）的分析方法，優(yōu)化了提取條件和檢測方法，回收率、定量限等參數(shù)完全能夠滿足現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)的要求，為豬肉制品中SAs藥物殘留安全監(jiān)測提供一個快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺甲噻二唑、磺胺異惡唑、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲惡唑（純度均>99%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、正己烷為色譜純試劑 德國Merck公司；其他試劑為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為Mill-iQ高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜 美國安捷倫公司；API5000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；TURRAX T25型均質(zhì)器 德國IKA公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；全自動氮吹濃縮儀 美國Capiler Life Sciences公司；色譜柱 美國Phenomenex公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃條件下避光保存。移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-18℃條件下避光保存。根據(jù)需要用空白豬肉提取液逐級稀釋配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 液相色譜條件

Kinetex C18色譜柱（100mm×2.1mm，2.6?m）；流速0.3mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography

時間/min 流動相A：0.1%甲酸水溶液/% 流動相B：乙腈/%

0 90 10

5.0 10 90

8.0 10 90

8.1 90 10

10.0 90 10

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：5500V；離子源溫度TEM：550℃；碰撞氣CAD（N2）：4 psi；氣簾氣CUR（N2）：30 psi；GS1：50L/h；GS2：50L/h；駐留時間為20ms；入口電壓EP：10V；監(jiān)測離子對、去簇電壓和碰撞能量詳見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

Table 2 Operating parameters of mass spectrometry

化合物 母離子（m/z） 子離子（m/z） 去簇電壓/V 碰撞能量/eV

磺胺吡啶 250.3 156.2*

108.2 77 23

37

磺胺嘧啶 251.3 156.2*

108.2 89 23

32

磺胺噻唑 256.3 156.2*

108.2 91 21

34

磺胺甲基嘧啶 265.3 156.2*

108.2 90 23

34

磺胺異惡唑 268.3 156.2*

113.3 80 19

24

磺胺甲噻二唑 271.3 156.2*

108.2 80 21

35

磺胺二甲基嘧啶 279.3 186.2*

124.3 110 26

36

磺胺氯噠嗪 285.3 156.2*

108.2 62 22

37

磺胺喹惡啉 301.4 156.2*

108.2 105 21

36

磺胺二甲氧嘧啶 311.4 156.2*

108.2 130 27

40

磺胺醋酰 215.2 156.2*

108.2 78 16

27

磺胺甲氧噠嗪 281.3 156.2*

108.2 140 22

33

磺胺甲惡唑 254.3 156.2*

108.2 130 22

32

注：*為定量離子。

1.3.4 樣品處理

稱取樣品2g（精確至0.01g）于離心管中，加入4g無水硫酸鈉，加入8mL 1%乙酸-乙腈，均質(zhì)提取2min，以4000r/min離心4min，然后取上清液轉(zhuǎn)移至20mL試管中，在45℃水浴下氮氣吹干用1mL含有0.1%甲酸的乙腈定容，渦旋，再加入2mL正己烷除脂，渦旋。以15000r/min離心3min，經(jīng)0.2μm有機(jī)相濾膜過濾，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的優(yōu)化

乙腈具有很強的組織滲透力，作為提取試劑在食品中磺胺類藥物的分析中應(yīng)用最為廣泛。結(jié)果表明，乙腈對豬肉中各藥物的提取回收率在51%～77%之間。考慮到磺胺類化合物均易溶于弱酸性溶液，因此選用1%乙酸-乙腈作為提取溶劑進(jìn)行提取實驗，表明該提取試劑不僅去除蛋白的效果好，而且容易濃縮，提取回收率也有所提高，可達(dá)60%～89%。因此在后續(xù)實驗中均選擇1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。另外，在樣品提取時加入無水硫酸鈉可以有效地防止樣品中的水分及干擾成分進(jìn)入提取液，同時硫酸鈉的存在可促使蛋白質(zhì)的變性分散，防止樣品結(jié)成塊狀影響提取。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別對100ng/mL各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，并優(yōu)化各分子離子的去簇電壓。然后分別以上述離子為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，選擇豐度較高、干擾較小的兩對子離子為定性離子，峰度最高的作為定量離子，然后優(yōu)化其碰撞能量（優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2），使得分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度達(dá)到最大時為最佳。圖1、2顯示了13種磺胺類藥物在優(yōu)化條件下的TIC圖和MRM色譜圖。

圖1 13種磺胺類藥物的TIC圖

Fig.1 TIC chromatograms of meat spiked with 13 sulfonamides

a.磺胺吡啶；b.磺胺嘧啶；c.磺胺噻唑；d.磺胺甲基嘧啶；e.磺胺異惡唑；f.磺胺甲噻二唑；g.磺胺二甲基嘧啶；h.磺胺氯噠嗪；i.磺胺喹惡啉；j.磺胺二甲氧嘧啶；k.磺胺醋酰；l.磺胺甲氧噠嗪；m.磺胺甲惡唑。

圖2 13種磺胺類藥物的MRM色譜圖

Fig.2 MRM chromatograms of meat spiked with 13 sulfonamides

2.3 線性范圍和定量限

取一系列混合藥物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、300.0ng/mL），以峰面積Y和對應(yīng)的質(zhì)量濃度X（ng/mL）作圖，如表3所示，在1～300ng/mL范圍內(nèi)，各藥物質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99。磺胺藥物的定量限如表3所示，均小于10μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美日等國家設(shè)定的殘留最大限量，說明該方法的靈敏度完全適合日常分析的要求。

表3 13種磺胺類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和定量限

Table 3 Linear equation， correlation coefficient， recovery and limit of quantification of 13 sulfonamides

藥物 線性方程 相關(guān)系數(shù) 回收率/% 定量限/

（μg/kg）

1μg/kg 2μg/kg 10μg/kg

磺胺吡啶 Y=4235X+3600 0.9992 62.9 62.8 61.1 8

磺胺嘧啶 Y=3154X+7890 0.9989 68.4 63.8 76.4 5

磺胺噻唑 Y=2120X+2890 0.9994 66.2 73.4 62.3 5

磺胺甲基嘧啶 Y=3182X+2110 0.9990 64.1 69.7 62.6 5

磺胺異惡唑 Y=5390X+4090 0.9988 61.1 63.5 69.1 8

磺胺甲噻二唑 Y= 2605X+2890 0.9996 63.8 67.1 67.6 4

磺胺二甲基嘧啶 Y=2980X+2100 0.9991 69.2 72.8 78.1 4

磺胺氯噠嗪 Y= 2210X+3130 0.9988 62.8 62.1 66.3 5

磺胺喹惡啉 Y=2900X+2890 0.9999 60.0 60.7 65.6 5

磺胺二甲氧嘧啶 Y=956X-2280 0.9995 65.9 61.2 64.1 4

磺胺醋酰 Y=9990X+1230 0.9993 60.4 61.8 68.1 8

磺胺甲氧噠嗪 Y=3670X+6920 0.9992 69.6 77.2 65.7 5

磺胺甲惡唑 Y=3715X+4210 0.9996 63.1 73.1 66.4 5

2.4 回收率和精密度

用空白豬肉樣品進(jìn)行添加回收率和精密度實驗，樣品添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后勻漿，放置過夜，使標(biāo)準(zhǔn)品在樣品中實現(xiàn)充分的交換平衡，然后按上述方法進(jìn)行提取、凈化和液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定，其回收率和精密度結(jié)果見表3。在添加水平1、2μg/kg和10μg/kg時，其回收率在60.0%～78.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.24%～8.88%，說明該方法具有很好的回收率和重現(xiàn)性。

3 結(jié) 論

所發(fā)展的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜方法可在10min內(nèi)完成13種磺胺類藥物殘留的定量和確證性分析，結(jié)合液液萃取和高選擇性的MRM模式，很好地實現(xiàn)了樣品與雜質(zhì)的分離，省去了固相萃取步驟，大大提高了分析效率。前處理步驟簡單快速，重復(fù)性好。13種磺胺類藥物具有很寬的線性范圍，回收率在60%～78.1%，定量限均小于10μg/kg，遠(yuǎn)低于歐美日設(shè)定的殘留最大限量。此方法操作簡便，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均滿足殘留分析的要求，完全可滿足國內(nèi)外對豬肉中磺胺類化合物的快速、準(zhǔn)確的檢測要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] AOAC Official Method 983.31， Sulfonamide Residues in Animal Tissues Thinlayer Chromatographic Screening Methods[S]. 1984.

[2] REEVES V B. Confirmation of multiple sulfonamide residues in bovine milk by gas chromatography-positive chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B： Biomedical Sciences and Applications， 1999， 723（1/2）： 127-137.

[3] PECORELLI I， BIBI R， FIORONI L， et al. Validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in muscle according to the European Union regulation 2002/657/EC[J]. Journal of Chromatography A， 2004， 1032： 23-29.

[4] HELA W， BRANDTNER M， WIDEK R， et al. Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC-DAD for detection[J]. Food Chemistry， 2003， 83（4）： 601-608.

[5]潘葳， 饒秋華， 蘇德森. 鰻魚中五種磺胺類藥物殘留的測定[J]. 色譜， 2004， 22（2）： 186.

[6] FUH M R S， CHU Suyi. Quantitative determination of sulfonamide in meat by solid-phase extraction and capillary electrophoresis[J]. Analytica Chimica Acta， 2003， 499： 215-221.

[7] CAVALIERE C， CURINI R， Di CORCIA A， et al. A simple and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry confirmatory method for analyzing sulfonamide antibacterials in milk and egg[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（3）： 558-566.

[8]龐國芳， 曹彥忠， 張進(jìn)杰， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定家禽組織中16種磺胺殘留[J].分析化學(xué)， 2005， 33（9）： 1252-1256.

[9]董丹， 邵兵， 吳永寧， 等. 液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定雞肉中17種磺胺類藥物的殘留[J]. 色譜， 2005， 23（4）： 404-407.

[10] 晏利芝， 趙永彪， 富玉， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肉中受體激動劑、喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留量[J]. 分析試驗室， 2011， 30（1）： 84-86.

[11] 劉佳佳， 佘永新， 劉洪斌， 等. 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中24種磺胺類藥物殘留[J]. 分析試驗室， 2011， 30（2）： 9-13.

[12] 佘永新， 劉佳佳， 王靜， 等. 超高壓液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法對牛奶中24種磺胺類藥物殘留的檢測[J]. 分析測試學(xué)報， 2008， 27（12）： 1313-1317.

[13] 陳坤才， 劉莉治， 彭榮飛， 等. 電噴霧超高效液質(zhì)聯(lián)用法測定動物性食品中磺胺類藥殘留[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2012， 22（9）： 2034-2036； 2040.

[14] 孫偉紅， 冷凱良， 王志杰， 等. HPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法同時測定水產(chǎn)品中18種磺胺類藥物殘留量[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29（24）： 294-298.