邱德義 胡佳等

摘 要：以DNA條形碼技術(shù)鑒別進出口監(jiān)督抽檢的魚肉等水產(chǎn)制品的種類來源，用以判別其與申報或產(chǎn)品標簽是否相符。分別提取魚肉等樣品的基因組DNA，以目前國際上比較公認的動物線粒體細胞色素氧化酶CO Ⅰ基因通用引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析后，將得到的擴增片段序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，同時提交Barcoding Life DNA條形碼數(shù)據(jù)庫（BOLD）進行鑒定分析。本批次監(jiān)督抽檢的16份魚肉、魚丸等水產(chǎn)制品中除1份樣品未能成功獲得魚肉CO Ⅰ PCR擴增外，其余15份樣品均順利得到種類來源鑒定，鑒定結(jié)果約有31.25%的樣品與產(chǎn)品標簽標示不符。作為一種簡單、快速、有效的分子鑒定技術(shù)，DNA條形碼可以直接應(yīng)用于魚肉等動物源性食品的種類鑒定。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；冷凍魚肉；動物源性食品；種類鑒定

中圖分類號：Q95 文獻標志碼：B 文章編號：1001-8123（2013）04-0040-04

《晏子春秋：內(nèi)篇雜下第一》中就有“懸牛首賣馬肉”之說，民間也有“掛羊頭賣狗肉”的演繹，其根本內(nèi)涵就是：表里不一、狡詐欺騙。在商貿(mào)領(lǐng)域表現(xiàn)為以次充好，甚至假冒、仿造貴重物品，欺騙消費者從而達到獲取更高非法利益的真實目的。進入2013年，在有著最嚴格食品安全監(jiān)管制度的歐盟，真實演繹了席卷歐洲列國的牛肉標識欺詐事件。不僅涉及到食品摻假欺詐的商業(yè)行為而且涉及到民族和宗教信仰的問題，引起不食用馬肉和豬肉的穆斯林和猶太人的強烈不滿。馬肉也引發(fā)食品安全的擔憂，部分馬肉中已檢測出苯基丁氮酮藥物殘留，此藥物經(jīng)常用于馬類，有助于止痛和退熱，但對人類有害。受“馬肉風波”事件影響，被忽視多年的海鮮產(chǎn)品以次充好現(xiàn)象也再度浮出水面。

摻假造假的判定和標簽制度的有效實施，必須建立在快速、準確的食品物種鑒定的基礎(chǔ)上。對加工食品而言，物種的原始可識別形態(tài)特征消失，這使得物種的鑒別變得相對困難。因此，迫切需要一些靈敏、可靠的檢測方法來鑒定動物食品或動物源性加工食品的物種來源。

DNA條形碼技術(shù)（Barcoding）是近幾年興起的一種分子生物學(xué)新技術(shù)，原理是利用基因組DNA中一段標準的或者被公認的基因片段，作為分子靶標來進行種級水平的種類鑒定。DNA條形碼技術(shù)對鑒定者的經(jīng)驗和專業(yè)知識背景要求較低，為物種的鑒定提供了新的手段，彌補了傳統(tǒng)分類的諸多不足。但條形碼鑒別技術(shù)需要有專門的數(shù)據(jù)庫作為支撐，含有較全面的生物學(xué)信息[1-2]。

利用分子標記進行物種種類鑒定國際上已有不少的嘗試，Hebert等[3-4]于2003年發(fā)表了國際上第一篇利用DNA 條形碼進行物種鑒定的論文，隨后Ball等[5]嘗試用分子條形碼鑒別了70多種水生蜉蝣，游中華等[6]用線粒體CO I鑒別了入侵害蟲西花薊馬及其他8種常見薊馬；岳巧云等[7-8]將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于出入境檢驗檢疫把關(guān)，成功對醫(yī)學(xué)媒介生物進行種類鑒定并建立數(shù)據(jù)庫。Wong等[9]利用DNA 條形碼技術(shù)對市場上的91個海產(chǎn)品樣品進行分析，推斷出可能有25%海產(chǎn)品的標簽與實物不符，認為DNA 條形碼技術(shù)是一種經(jīng)濟的、有效的、可將海產(chǎn)品鑒定到種的分子鑒別技術(shù)。在我國，DNA條形碼技術(shù)用于食品鑒別的文獻報道較少，常見的動物源成分鑒定技術(shù)應(yīng)用的是特異PCR、熒光PCR等技術(shù)，也頒布了一部分行業(yè)檢測標準，但其局限性顯而易見。柳淑芳等[10]報道了DNA條形碼技術(shù)在魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用，為該項技術(shù)在魚種類鑒別中的應(yīng)用前景提供了有力支持。

本實驗室應(yīng)用線粒體CO Ⅰ片段為靶標，CO Ⅱ、CO III以及ITS等作為備用標靶和確證基因，對進出口監(jiān)督抽檢及口岸截獲的多批次包括魚肉、魚片、蝦餃、魚丸等水產(chǎn)和水產(chǎn)制品進行檢測鑒定，并通過分析比對進行了確認。龍利魚（Cynoglossus macrolepidotus） 自然資源量少，味道鮮美，為一種高檔海鮮。本實驗將以其中一份申報為龍利魚柳凍魚肉的檢測鑒定作為典型范例，對DNA條形碼技術(shù)在進出口檢驗監(jiān)管方面的應(yīng)用做一分析和介紹。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究樣本為從各進出口食品企業(yè)監(jiān)督抽檢的多批次包括魚肉、魚片、蝦餃、魚丸、蝦醬等水產(chǎn)和水產(chǎn)制品以及口岸截獲的冷凍魚肉。

動物組織基因組DNA 提取試劑盒、PCR產(chǎn)物及DNA片段回收試劑盒、T4連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞 天根生化科技北京有限公司；EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 1-15pk冷凍離心機 德國Sigma公司；S1000梯度PCR儀、Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYCP-31E電泳儀 北京六一儀器廠； NanoDrop 1000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

魚肉基因組DNA提取均采用動物組織基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒使用手冊進行基因組DNA提取，對個別魚肉樣品適當延長蛋白酶消解時間。

1.3.2 PCR擴增

PCR擴增所用引物為：LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，HCO2198 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[10-11]，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（50?L）：10倍PCR緩沖液5?L；正向引物（20?mol/L）2.5?L；反向引物（20?mol/L）2.5?L；dNTP（10mmol/L）1.5?L；Ex-Taq 1?L；模板DNA 2?L；無菌水定容到50?L。

EX-Taq DNA聚合酶擴增條件：94℃變性5min；94℃、40s，54℃、40s，72℃、1min，反應(yīng)40個循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR 擴增完成后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離后，使用數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)分析擴增產(chǎn)物。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物直接測序時，將獲得的PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書的操作步驟割膠純化，送深圳華大基因有限公司進行雙向測序，測序引物同于擴增引物。所得的測序結(jié)果經(jīng)拼接并刪除兩端引物序列，獲得最終的擴增序列。

1.3.4 PCR產(chǎn)物克隆測序

克隆測序用于驗證PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的準確性，尤其針對多成分肉制品的PCR產(chǎn)物采用挑選不同陽性克隆進行測序分析。對PCR產(chǎn)物進行純化，隨后按T-vector試劑盒推薦反應(yīng)體系與pGEM-T載體連接，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細胞中，36℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)過藍-白斑篩選后，挑取3～10個不同的白色單菌落進行菌落PCR驗證。陽性克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基（含有100μg/mL氨芐青霉素）中，在36℃、180r/min搖床上培養(yǎng)過夜，吸取菌液1mL抽提質(zhì)粒DNA，并送深圳華大基因進行測序。測序引物采用T7通用測序引物。

1.3.5 擴增序列分析比對

PCR產(chǎn)物直接測序或克隆測序后，去除擴增引物序列，提交GenBank進行BLAST比對[12]，并使用BOLD網(wǎng)站[13]的數(shù)據(jù)庫對樣品的CO I序列進行鑒定以及相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體CO Ⅰ基因片段的擴增

以動物基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA后，應(yīng)用CO Ⅰ通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，冷凍魚、魚丸、蝦餃、蝦醬等水產(chǎn)品的CO Ⅰ序列可以用通用引物擴增出來，說明通用引物的通用性高，可用于魚肉中CO Ⅰ基因的擴增。圖1顯示的是申報為龍利魚柳冷凍魚肉的CO Ⅰ、CO Ⅱ、ITS擴增及一份魚丸樣品的CO I序列擴增。

2.2 冷凍魚柳CO Ⅰ測序結(jié)果分析

對龍利魚柳冷凍魚肉樣品的PCR產(chǎn)物直接測序和克隆測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件驗證，圖譜一致，且為有效序列。經(jīng)比對分析，從PCR全長序列中去除兩端引物的堿基，所得有效序列為658bp。

2.3 與GenBank中的序列比對

冷凍龍利魚柳的PCR產(chǎn)物所測定序列與GenBank中核酸序列進行BLAST比對，結(jié)果與編號gb|JN021313.1公布的654bp的Pangasianodon hypophthalmus線粒體CO I序列相似性為99.8%，其中僅有1個堿基差異。詳細信息如圖2所示。

2.4 與BOLD數(shù)據(jù)庫中的序列比對分析

將PCR擴增并測序得到的CO Ⅰ有效序列提交BOLD （Barcoding life）DNA條形碼數(shù)據(jù)庫分析，鑒定結(jié)果取相似度最高的前8位，見表1。

該冷凍魚肉樣品為口岸截獲，進口商在入境申報時申報該冷凍魚肉樣品為龍利魚柳，被截獲后改稱巴沙魚。本實驗室取樣進行CO Ⅰ PCR擴增，測序結(jié)果分別經(jīng)GenBank Blast比對及BOLD DNA條形碼數(shù)據(jù)庫分析，鑒定名稱為Pangasianodon hypophthalmus，學(xué)名蘇氏圓腹魚芒，屬魚芒鯰科（Pangasiidae），分類學(xué)上在屬一級小有爭議，中文名多稱為巴丁魚。目前國內(nèi)水產(chǎn)品市場多存在混淆名稱的“潛規(guī)則”現(xiàn)象。以本批次樣品為例，國內(nèi)賣家近年來通稱越南巴沙魚為龍利魚，而包括多家水產(chǎn)門戶網(wǎng)站也都將巴丁魚歸為巴沙魚家族的一員。其實3者是不同的魚種，巴丁魚和巴沙魚的區(qū)別非常小，主要是魚的口舌位、魚胸鰭條目數(shù)等略有差別，而龍利魚則親緣關(guān)系較遠，更為稀有和昂貴。

2.5 水產(chǎn)品檢測結(jié)果匯總及分析

本批次監(jiān)督抽檢共分析了16份進出口企業(yè)抽檢及口岸截獲魚肉、魚丸、蝦餃等水產(chǎn)制品，經(jīng)DNA條形碼技術(shù)分析鑒定，除一份魚丸樣品未能鑒定出水產(chǎn)種類之外，其余15份樣品均成功擴增CO Ⅰ基因片段，并通過GenBank和BOLD 數(shù)據(jù)庫比對分析鑒定出了水產(chǎn)種類，鑒定結(jié)果匯總見表2。

其中，未能成功PCR擴增的8號白魚丸樣品經(jīng)嘗試CO Ⅱ、CO Ⅲ及ITS等多個候選標靶基因均未能檢測到魚肉成分，ITS擴增鑒定存在大豆基因成分，除證實該樣品基因組DNA提取成功外，也暗示了其本身存在不含魚肉成分的可能。從嚴格意義上講，16份樣品中僅有2份的鑒定結(jié)果與標簽完全符合，占25.5%；約有31.25%的樣品鑒定結(jié)果與標簽標示不符。另有56.25%的樣品由于其標簽本身未能標示所含水產(chǎn)種類，而僅以魚或蝦的大類表示，根據(jù)檢測結(jié)果盡管不能判定其不合格，但也提示了產(chǎn)品標簽制度有需要進一步完善的地方。

需要說明的是，國際統(tǒng)一的生物物種命名應(yīng)用的是拉丁文名稱，DNA條形碼的鑒定結(jié)果給出的以拉丁文名為準。而國內(nèi)常用的學(xué)名及俗名則常常是五花八門，這也在客觀上為一些不法商家摻假、造假提供了可乘之機。

3 討 論

動物性食源物種種類繁多，非專業(yè)人士很難鑒別，且消費者在購買新鮮肉類、鮮活或冷凍水產(chǎn)品時，多是通過形態(tài)特征來判斷肉或魚的種類，但對于一些肉或魚肉制品（如肉餅、肉丸、魚片、魚丸等），則很難通過形態(tài)特征來判斷其原料的來源。食品行業(yè)一些不法商家正是利用此漏洞，為了追求最高商業(yè)利潤，便在加工食品中摻假造假，以低價食源冒充高價食品出售，一方面大大損害了消費者的利益和健康，另一方面也造成了不正當?shù)纳虡I(yè)競爭。其實，在此次“馬肉風波”事件之前，國內(nèi)已經(jīng)爆出了應(yīng)用化學(xué)藥物處理的“假魚翅”、以牛肉膏處理的豬肉或鴨肉冒充牛肉等事件，但當時輿論更多地導(dǎo)向了食品安全領(lǐng)域而非商業(yè)欺詐的造假本身。

DNA條形碼技術(shù)目前國際上比較公認的是以細胞色素C氧化亞基Ⅰ（CO Ⅰ）的基因作為鑒定物種的靶基因，現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明絕大多數(shù)物種的CO Ⅰ序列表現(xiàn)出低的種內(nèi)遺傳差異及相對較高的種間差異[14-15]。該項技術(shù)能避免形態(tài)學(xué)分類的缺陷，對鑒定者的經(jīng)驗和專業(yè)知識背景要求較低。相比較于特異PCR、熒光PCR等技術(shù)，DNA條形碼技術(shù)有著無可比擬的優(yōu)勢，但是DNA條形碼鑒別技術(shù)需要有專門的數(shù)據(jù)庫作為支撐。由于動物性食源種類繁多，目前的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫還遠遠不夠完善，應(yīng)用國際共享的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進行序列分析比對仍存在一定的不確定因素。同時，對于部分種類尤其是多成分加工食品的鑒別還需要在輔助靶基因[16]的篩選，與特異PCR、熒光PCR、AFLP及芯片技術(shù)相結(jié)合等方面進一步探索。

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